T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.
Lymfocyttproliferasjon som svar på antigen eller mitogen stimulering er en lett målbar fenomen nyttig for testing av immunmodulerende (dvs. immunosuppressiv eller immunstimulerende) kjemiske forbindelser og biologiske. En av de tidligste trinnene under mitogenesis er cellen utvidelse eller blastogenic transformasjon, hvorpå cellevolumøkninger før divisjon. Det er vanligvis påvises i de første timene av T-lymfocytt stimulering. Her beskriver vi en rask metode for å kvantifisere blastogenese i T-lymfocytter isolert fra mus milt og humane perifere mononukleære blodceller (PBMC) ved hjelp av en automatisert celleteller. Ulike brukte spredningsanalyser for det meste er arbeidskrevende og bare reflekterer den generelle befolkningen effekt snarere enn individuelle cellulære effekter i en befolkning. I kontrast, gir det fremlagte automatisert celleteller analysen rask, direkte og presise målinger av cellediameter som kan væreanvendt for å vurdere effektiviteten av forskjellige mitogener og immunmodulerende midler in vitro.
T-lymfocytter er de primære celler er ansvarlige for adaptiv immunitet i pattedyr. Det er kjent at de reagerer på spesifikke antigene peptider presentert av MHC-molekyler på overflaten av antigen-presenterende celler. Ved aktivering av en beslektet T-celle-reseptor (TCR), forstørrer celle i en prosess kalt blastogenic transformasjon, eller blastogenese. Denne prosessen er detekterbar i den første ~ 6 timer etter at stimulus er påført en. Under blastogenese, volumene av de enkelte T-celler øke 2- til 4-ganger 2-6. Lymfocytter begynner å spre seg i en prosess som kalles klonal ekspansjon, som har til formål å generere så mange kloner av de antigen-spesifikke TCR-bærende celler som mulig. Avkommet Cellene da utøve sin immunologiske funksjon ved å differensiere til cytotoksisk (CD8 +) eller hjelper (CD4 +) effektor T-lymfocytter. Således naive T-lymfocytter i human eller mus blod er i G 0 (hvile)-fasen av cellesyklus og støtte minimal metabolsk aktivitet. Ved eksponering for antigener eller mitogener, T-celler oppgi cellesyklus, med en ledsagende stimulering av transkripsjon og proteinsyntese 7-10. Mitogener, såsom forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) og ionomycin stimulere lymfocyttene gjennom aktivering av proteinkinase C (PKC) og Ca 2 + -avhengige signalveier 1. Aktiveringen av T-celler med PMA / ionomycin styrer TCR-signaliseringstrinn.
In vitro proliferasjon analyser er mye brukt for det formål å evaluere lymfocytt-funksjon og respons på stimuli. Spredningsmålinger blir vanligvis tatt en til tre dager etter starten av T-cellestimulering og reflektere den kollektive tilstand av hundrevis eller tusenvis av celler. Styrken av forskjellige mitogener og immunmodulerende medikamenter in vitro kan evalueres ved ganske enkelt å måle sprednings priser i nærvær av disse forbindelser. Noen av disse enssays og deres begrensninger er omtalt nedenfor.
For direkte celle nummer telling, er fremgangsmåten tidkrevende, med en høy sannsynlighet for operatørfeil.
For DNA-syntese, måler 3H-tymidin inkorporering analyse DNA-syntese, men dens viktigste begrensningen er dens radiotoksisitet. En ikke-radioaktiv alternativ er BrdU, men omfanget av lineær respons for cellevekst er begrenset, og antistoff-behandling er nødvendig, noe som øker det antall trinn i prosedyren 11,12.
For metabolske aktivitet, tetrazoliumsalter (MTT, MTS, XTT, og WST-1) og resazurin fargestoffbaserte kolorimetriske assays rapportere den generelle metabolske tilstand av delende cellepopulasjoner. Imidlertid er MTT ikke er løselig i dyrkningsmediet, noe som krever ytterligere vasketrinn, således som omfatter feil i målingen; XTT trenger tilleggskomponenter for å redusere effektivt; MTS-, WST-1, og Resazurin baserte målinger er påvirkeed av kulturmediet pH-verdi og dens komponenter serum albumin eller fenolrødt 13-16. Disse analyser måler ikke den faktiske antallet levedyktige celler, men snarere anslå de kombinerte enzymaktiviteter. Derfor formeringshastigheten kan ikke bestemmes nøyaktig ved metabolske analyser på grunn av ikke-lineær korrelasjon mellom cellenummer og fargestoff reduksjon 12,17.
For måling av ATP konsentrasjon, T-celle aktivering-indusert økning i ATP korrelerer med spredning. Imidlertid heving av intracellulær ATP er en av den første delen av T-celleaktivering; mange skritt bak er selve spredning 17,18.
For fargestoff fortynning analysen, flekker CFSE fluorescerende fargestoff celler ved kovalent binding til intracellulære proteiner. Fargestoffet viser en spredning avhengig reduksjon i fluoriserende intensitet, noe som kan spore antall celledelinger. Men på grunn av kovalente protein merking, funksjoner av disseproteiner kan bli kompromittert. Fargestoffet er toksisk for cellene ved høyere konsentrasjoner. Ved lavere fargestoffkonsentrasjoner, er imidlertid den første fluorescensintensitet redusert, redusere antall celledelinger som kan spores. I tillegg, etter merking med CFSE, er det en spredning uavhengig ~ 50% tap av opprinnelig fluorescens i løpet av den første 24 til 48 timers periode, noe som begrenser det dynamiske området for denne analysen 19,20.
De fleste av disse analyser reflektere den kollektive tilstand av et stort antall celler og krever behandling av cellene med fluorescente fargestoffer. Nekrotiske og apoptotiske celler kan også bidra til disse målingene, med mindre de er fjernet fra analysen ved farging med kjemikalier eller antistoffer.
Lymfocytt blastogenese kan evalueres ved en rekke metoder, slik som optisk mikroskopi eller flowcytometri 4,21,22. Her beskriver vi en hurtig metode for måling av T-cellestørrelser ved hjelp av enn automatisert celleteller, som samler sanntidscelle bilder som er lagret og kan bli re-analysert på et senere tidspunkt. I tillegg til størrelsesmålinger, gir denne anordning presise celle tall og den prosentandel av levedyktige celler, som bestemt ved trypan blå eksklusjon flekk. Anordningen som brukes i denne protokollen er kommersielt tilgjengelig, og produsenten testet presisjonen av instrumentet ved hjelp av tre forskjellige instrumenter og flere konsentrasjons- og levedyktighet kontroller. Resultatene fra disse studiene viser en koeffisient av avviket som var generelt under 6%. Som nevnt i protokollen, enheten kalibreres med jevne mellomrom med 6 mikrometer og 8 mikrometer diameter polystyren perler. Fordelene med å bruke en celleteller for å skille mellom hvilende T-celler og T-lymfoblaster basert på cellediameteren er brukervennlighet og den automatiserte arten av analysen. Programvaren er i stand til å tegne en sirkel rundt hver celle og beregning av cellediameteren. I tillegg er imaldre er synlige for brukeren, som kan kontrollere riktigheten av instrumentet til å identifisere de celler, og på riktig måte å tegne en sirkel rundt dem. Når det gjelder begrensninger, kan instrumentet ikke per se skille mellom avfall og celler; Derfor er det viktig at operatøren ser hvert bilde som det blir behandlet. Det er mulighet for å innlemme luftbobler, noe som vil redusere antallet av brukbare felt for analyse; Dette er imidlertid sjelden hvis det vanlige spyle det utføres vedlikehold.
I denne studien ble grupper av milt-T-lymfocytter stimulert med ionomycin og økende konsentrasjoner av PMA til 12-48 timer. konsentrasjoner så lave som 2 ng / ml indusert både en robust blastogenic svar og betydelig spredning PMA. Målinger av effekten av flere legemidler, slik som immundempende ciklosporin A (CsA), FK506 (tacrolimus), og rapamycin (sirolimus), samt ion kanalblokkere TRAM-34 og FTY720 (fingolimod), på blastogenese viste god overensstemmelse med rapporterte effekter på proliferasjon. Den blastogenic respons av humane PBMC til PMA / ionomycin og murin T-celle stimulering med anti-CD3 og anti-CD28 antistoff-belagte magnetiske kuler ble også målt.
Den celleteller assay kvantifiserer både blastogenese og formeringshastigheten (celletetthet) samtidig, men hver for seg, i motsetning til de ovenfor nevnte fremgangsmåter, som ser ved en kombinasjon av disse effekter. Den presenterte protokollen gir en hurtig og robust teknikk for å vurdere styrken av mitogene og immunmodulerende midler.
Her beskriver vi en teknikk for rask påvisning og kvantifisering av T-celle blastogenic transformasjon ved hjelp av et automatisk celleteller. Under våre betingelser (250 ng / ml PMA og ionomycin 250 nM stimulering) ble celleoverflatearealet økes to ganger og volumet tre ganger etter 48 timer med aktivering. Analysen er tilstrekkelig følsom til å påvise sprengning i løpet av de første 12 timer av aktivering, hvor cellevolumet økte bare 1,25 ganger sammenlignet med hvilende (figur 2D). En mer fysiologisk relevant mekanismen for T-celleaktivering ved anvendelse av anti-CD3 og anti-CD28 antistoff-belagte magnetiske kuler ga en signifikant blastogenic reaksjon, med et gjennomsnitt 2,3 ganger økning i volum (72 timer etter aktivering, figur 3D). Humane mononukleære celler viste en 2,6-gangers volumendring ved PMA / ionomycin stimulering i 48 timer (figur 4). ICR mus milt T-celle gjennomsnittlig diameter og volum ble bestemt til å være6,9 um og 1,9 x 10 -4 nl, respektivt. Humane PBMC (fra en frisk donor) hadde en gjennomsnittlig diameter på 7,7 um og et gjennomsnittlig volum på 2,7 x 10 -4 nl. Ved hjelp av denne protokoll har vi også testet økende konsentrasjoner av PMA for deres evne til å aktivere T-celler. Disse encellede resultater var i overensstemmelse med proliferasjonsanalyser utført ved lignende konsentrasjoner PMA.
Flere forbindelser rapportert å påvirke celledeling ble testet: FTY720 31,32; den immunsuppressive cyklosporin A, FK506, og rapamycin 27,28; og TRAM-34, en blokkering av kalsiumaktiverte KCa3.1 kanaler 33,35. Vi har funnet at ved de testede konsentrasjoner, de mest potente inhibitorer av blastogenese ble CsA og FK-506. Rapamycin hadde en mindre, men statistisk signifikant hemmende effekt på blastogenese. TRAM-34, på den annen side, ikke påvirker blastogenese.
CsA trykt både blastogenese og proliferation, men ikke fullstendig (figur 2B og 2C), som viser at automatisk celleteller måling er en god korrelat av medikament effektivitet i T-celle-proliferasjon. I nærvær av rapamycin sammen med CsA, blastogenese ble fullstendig hemmet, noe som tyder på at NFAT- og mTOR-medierte baner i kombinasjon fullt ut kan stå for T-celle-utvidelse ved mitogen stimulering med PMA / ionomycin (figur 3C).
Det dynamiske området for noen proliferasjonsanalyser er begrenset (se figur 2). Proliferasjonsanalyser, slik som den vi har brukt (figur 2C), rapporterer et signal som inkluderer bidrag fra apoptotiske og nekrotiske celler. Automatiserte endrings diameter målinger har ikke den begrensningen, som målingene gjelder bare levedyktige celler. Celleviabilitet vurderes av utelukkelse av trypanblått flekk fra sunne, levedyktige celler. I størrelse målinger, ved terminlysspredning i flowcytometri dublett celle diskriminering kan være problema 22. I den automatiserte celleteller målinger, ble det ikke funnet dublett populasjonen (figur 1). Dessuten målingen var tilstrekkelig presis til å skjelne mellom effektene av 100 og 200 nM cyklosporin (tabell 1) og for å detektere blastogenese innen 12 timer fra mitogen stimulering (figur 2D).
Denne nye analysen er spesielt nyttig for et lite antall prøver. Opp til 15 prøver kan måles i en time. Imidlertid har analysen sine begrensninger, de fleste som kan reduseres. Selv om det kan effektivt løse små (<1 um) forskjell i cellediameter, maskinmodell brukte vi har en lavere deteksjonsgrense på 5 um. Denne grensen kan føre til overvurdering av meget små cellestørrelser, fordi den effektivt utelukker alle celler med mindre diametre. Men nyere modeller av celleteller ha deteksjon treskeåringer på ~ 2 mikrometer, som skal avhjelpe dette problemet. Dersom det er for mye smuss i prøven, behandler instrumentet dem som levedyktige celler. I tillegg kan luftbobler tidvis komme inn i flyten celle og forårsake forvrengning av celle bilder tatt av maskinen. Den forvrengning synes ikke å påvirke levedyktigheten bestemmelse, men det kan påvirke de målte diametere. Derfor anbefales det at alle bildene kontrolleres av eksperimentator for luftbobler før dataene fra hver studie er akseptert for analyse. Ettersom programvaren bare trekker sirkler rundt cellene, kan diametrene av ikke-sfæriske celler være skjevt mot lengdeaksen, slik at analysen mindre egnet for ikke-sfæriske celler.
Denne analysen er rask, tar ca 4 minutter per prøve, sammenlignet med proliferasjonsanalyser, som krever noen få timer. Datainnsamlingen er også ganske enkel å bruke programvaren som følger med enheten. Programvaren kan eksportere måledata til en spreadsheet for analyse. Endelig er det en enkelt-celle, i motsetning til en populasjon, måling; både blastogenese og spredning måles; og det skiller mellom levedyktige og døde celler samtidig. Den kan brukes til å evaluere forskjellige musestammer for deres evne til å montere en immunrespons. Målingen kan også brukes med hell for måling av blastogenese i T-celler fra humane donorer (figur 4), og det kan også brukes i andre celletyper.
Cell volumøkninger er kjent for å bidra til regulering av metabolismen: celle hevelse stimulerer glutamin-indusert glykogen syntese og lipogenese i hepatocytter 36,37. Nøytrofile vise migrasjonsrelatert økning på 35-60% volum, mens kjemotaktiske agenter tale 10-15% hevelse 38-40. Den nåværende analysen kan potensielt brukes til å studere disse prosessene.
The authors have nothing to disclose.
We thank Lucile Wrenshall for the use of the plate reader, Nancy Bigley for useful discussion, and Tom Brown for the gift of ICR mice. This work was funded by grant 1R01AI114804 from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases and by WSU Faculty Development funds (to J.A.K.). J.N.G. was supported in part by the National Institute of General Medical Sciences grant R25GM090122.
RPMI-1640 | Lonza | BW12-702F | |
40 μm nylon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
nylon wool fiber columns | Polysciences, Inc. | 21759-1 | |
50 ml conical tubes | The Lab Depot | TLD431697 | |
6-well cell culture treated plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
96-well cell culture treated plates | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-100 | |
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | MTS based assay |
Cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024 | |
FK506 | Cayman Chemical Company | 104987-11-3 | |
Rapamycin | Santa Cruz Biotechnology | sc-3504 | |
TRAM-34 | Sigma-Aldrich | T6700 | |
FTY720 | Sigma-Aldrich | SML0700 | |
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 | Gibco | 11456D | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Acros Organics | 356150010 | |
Ionomycin calcium salt | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals | ICN1670049 | 100 x stock |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | HyClone | SH30378.02 | 10 x stock |
1,4-dithiothreitol (DTT) | Research Products International | 12/3/3483 | reducing agent |
8 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 84192-5ML-F | Actual 8.02 µm |
6 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 89756-5ML-F | Actual 6.084 µm |
Single magnetic separation stand for 1.5 – 2 mL tube | V&P Scientific, Inc. | VP772F5 | |
Cell culture incubator | Forma Scientific | 3110 | |
Synergy H1 hybrid reader | Bio Tek | BTH1M | |
Vi-CELL cell viability analyzer | Beckman Coulter | 731050 |