Udvikling af en raffineret protokol for Trans-scleral Subretinal Transplantation af menneskelige retinale Pigment epitel celler ind i rotte øjne
Summary
Subretinal injektion er blevet bredt anvendt i prækliniske studier af stamceller substitutionsterapi for aldersrelateret makuladegeneration. I denne visualiseret artikel beskriver vi en mindre risikabelt, reproducerbare og netop ændrede subretinal injektionsteknik via den trans-scleral tilgang til at levere celler til rotte øjne.
Abstract
Degenerative retinal sygdomme, såsom aldersrelateret Macula degeneration (AMD) er den hyppigste årsag til uoprettelige synstab på verdensplan. AMD er karakteriseret ved degeneration af retinale pigment epitel (ÅV) celler, som er en éncellelag af celler funktionelt støtte og anatomisk indpakning omkring neurale nethinden. Nuværende farmakologiske behandlinger for ikke-neovaskulær AMD (tør AMD) kun bremse sygdomsprogression, men kan ikke gendanne vision, nødvendiggør undersøgelser med henblik på at identificere nye terapeutiske strategier. Erstatter de degenerative ÅV celler med raske celler holder løfte om at behandle tør AMD i fremtiden. Omfattende prækliniske undersøgelser af stamceller udskiftning behandlingsformer for AMD involverer transplantation af stamceller-afledt ÅV celler i dyremodeller, hvor subretinal injektionsteknik er anvendt subretinal plads. Den tilgang, der oftest bruges i disse prækliniske dyreforsøg er gennem den trans-scleral rute, som er vanskeliggjort af manglen direkte visualisering nål afslutning og kan ofte resultere i nethinde beskadige. En alternativ fremgangsmåde gennem glasagtige giver mulighed for direkte observation af nål afslutning holdning, men det bærer en høj risiko for kirurgiske traumer som mere øjet væv er forstyrret. Vi har udviklet et mindre risikabelt og reproducerbare modificerede trans-scleral injektion metode, der bruger definerede nål vinkler og dybder til succes og konsekvent leverer ÅV celler ind i den rotte subretinal plads og undgå overdreven nethinde beskadige. Celler leveres på denne måde har tidligere vist sig for at være virkningsfuldt i Royal College of Surgeons (RCS) rotte i mindst 2 måneder. Denne teknik kan bruges ikke kun til celle transplantation, men også for levering af små molekyler eller genterapier.
Introduction
Den menneskelige nethinde placeret på bagsiden af øjet funktioner som en lys sensoriske væv og spiller en afgørende rolle i visionen opfattelse. Retinal celle dysfunktion eller celledød derfor forårsager problemer med synet eller permanent blindhed. Sygdomme involverer degeneration eller dysfunktion af celler i forskellige lag af nethinden er kendt som degenerative retinal sygdomme, blandt hvilke AMD er den mest almindelige type og den hyppigste årsag til uoprettelige blindhed i ældre i udviklede lande 1,2. Den patologiske proces af AMD er forbundet med “drusen” akkumulering mellem ÅV lag og de underliggende Bruchs membran, som igen forringer ÅV støtte af fotoreceptor fysiologi, fører til neurale retinal atrofi og vision tab3, 4,5. Hidtil, er der ingen kur for avanceret tørre (ikke-neovaskulær) AMD. Fremkomsten af stamcelleterapi som et nyt paradigme i regenerativ medicin bringer håb for at erstatte de dysfunktionelle eller døde ÅV celler med stamcelle-afledt raske celler. Faktisk, omfattende prækliniske undersøgelser af transplantere stamceller (fx, menneskelige embryonale stamceller)-afledte ÅV celler i ÅV-degenerative dyremodeller har været udført6,7, hvoraf nogle har udviklet sig til kliniske forsøg8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). For nylig en alternativ kilde til stamceller hjemmehørende i den menneskelige ÅV lag, de menneskelige RPE-stamceller (hRPESCs), blev identificeret af vores laboratorium og i øjeblikket bliver brugt i prækliniske studier af hRPESC afledt ÅV celle (hRPESC-RPE) transplantation terapi for AMD 10 , 11 , 12 , 13.
Subretinal injektionsteknik anvendes i ovennævnte af flere grupper, herunder vores gruppe prækliniske undersøgelser. Der er to generelle tilgange til subretinal injektion i dyr: trans-vitreal og trans-sclera. Trans-vitreal tilgangen har fordelen, at kirurgen at være i stand til direkte observere nål afslutning, da det trænger de forreste øje, krydser hele vitreal hulrum støder op til linsen, og trænger nethinden bagest i øjet til at nå subretinal plads14,15,16. Det kræver imidlertid forstyrre nethinden i to steder (anterior og posterior), bærer risikoen for at beskadige linsen, og kan resultere i tilbagestrømning af celler ind i glaslegemet når nålen er trukket tilbage. Derimod trans-sclera metode, i princippet, undgår inddragelse af nethinden og glasagtige, og tilbagestrømning forlader øjet. I pigmenteret gnavere, kirurgen kan i første omgang observere penetration af sclera, men efter passage i pigmenteret årehinden, nål afslutning er ikke længere synlig. Uden direkte observation, overtræder nethinden er fælles og kan resultere i retinal dissektion og levering af celler og/eller blod i glaslegemet. Desuden, fordi øjet overflade er buet, det er meget svært at vide hvilken nål vinkler og dybder er mest effektivt i trans-scleral injektioner.
I denne visualiseret artikel introducerer vi en trans-scleral subretinal injektion metode informeret ved brug af post-operative evalueringer med optisk kohærens tomografi (OCT), som giver mulighed for en detaljeret gennemgang af injektionsstedet. Vores trans-scleral injektionsteknik udnytter definerede steder, vinkler og dybder for injektion nåle til at producere meget lav Kirurgisk traume og høj pålidelighed. Her viser vi specifikt indsprøjtning af hRPESC-RPE celler i den subretinal plads af RCS rotte, en præ-klinisk model af menneskelige AMD. Med denne injektion metode leveret vi med succes og konsekvent hRPESC-RPE celler ind i subretinal rummet af RCS rotte øjne med en meget høj succesrate. Indsprøjtning af celler blev tidligere anset for at resultere i bevarelse af RCS fotoreceptorer i mindst 2 måneder efter injektion13. Denne procedure er udført under dissekere mikroskop og er let at lære. Det kræver to personer (en kirurg og assistent) at udføre injektionen og den gennemsnitlige tid for injektion for hvert dyr er mindre end 5 minutter. Definerede vinkler og dybder for injektion nåle gøre det muligt for laboratorierne, hvor OCT er ikke tilgængelig, til at opnå en vellykket subretinal injektion. Det giver mulighed for meget reproducerbare subretinal adgang og kan bruges ikke kun til celle transplantation, men også for drug delivery og gen terapier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den subretinal injektionsteknik afbildet i denne artikel er via den trans-scleral vej, hvor injektoren nål trænger de ydre lag (sclera-choroid-ÅV komplekse) på øje væggen uden at skade de neurale nethinden eller forstyrre Corpus vitreum-hulen. En alternativ trans-vitreal tilgang har en potentiel risiko for linsen skader fører til grå stær, da gnavere linse optager størstedelen af Corpus vitreum-hulen. Sammenlignet med denne metode, vores teknik er mindre risikabel og forårsager minimal traumer som injektoren n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Patty Lederman for hendes hjælp på kirurgi og Susan Borden for ÅV celle forberedelse. Vi anerkender også NYSTEM C028504 for finansieringen af dette projekt. Justine D. Miller understøttes af NIH give F32EY025931.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
References
- De Jong, P. T. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 355, 1474-1485 (2006).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ambati, J., Fowler, B. J. Mechanisms of agerelated macular degeneration. Neuron. 75, 26-39 (2012).
- Abdelsalam, A., Del Priore, L. V., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: Pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 358 (24), 2606-2617 (2008).
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Embryonic stem cells and retinal repair. Mech Dev. 124 (11-12), 807-829 (2007).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt’s macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Blenkinsop, T. A., et al. Human adult retinal pigment epithelial stem cell-derived RPE monolayers exhibit key physiological characteristics of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7085-7099 (2015).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
- Davis, J. R., et al. Human RPE Stem Cell-Derived RPE Preserves Photoreceptors in the Royal College of Surgeons Rat: Method for Quantifying the Area of Photoreceptor Sparing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 304-309 (2016).
- Westenskow, P. D., et al. Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension. J Vis Exp. (95), e52247 (2015).
- Lopez, R., et al. Transplanted Retinal Pigment Epithelium Modifies the Retinal Degeneration in the RCS Rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (3), 586-588 (1989).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Nair, G., et al. Effects of Common Anesthetics on Eye Movement and Electroretinogram. Doc Ophthalmol. 122 (3), 163-176 (2011).
- McGill, T. J., et al. Transplantation of human central nervous system stem cells – neuroprotection in retinal degeneration. Eur J Neurosci. 35, 468-477 (2012).
- Al-Hussaini, H., Kam, J. H., Vugler, A., Semo, M., Jeffery, G. Mature retinal pigment epithelium cells are retained in the cell cycle and proliferate in vivo. Mol Vis. 14, 1784-1791 (2008).
- Wang, S., Lu, B., Wood, P., Lund, R. D. Grafting of ARPE-19 and Schwann Cells to the Subretinal Space in RCS Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (7), 2552-2560 (2005).
- Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P. Induced corneal opacities in the rat. Br J Ophthalmol. 51 (2), 124-129 (1967).
