चूहा आँखों में मानव रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के ट्रांस-scleral रेटिना प्रत्यारोपण के लिए एक परिष्कृत प्रोटोकॉल का विकास
Summary
उप रेटिना इंजेक्शन व्यापक रूप से उम्र से संबंधित धब्बेदार अध-पतन के लिए स्टेम सेल प्रतिस्थापन थेरेपी के नैदानिक अध्ययन में लागू किया गया है. इस दृश्य लेख में, हम एक कम जोखिम भरा, प्रतिलिपि और ठीक ट्रांस-scleral दृष्टिकोण के माध्यम से संशोधित उप रेटिना इंजेक्शन तकनीक का वर्णन करने के लिए चूहे की आंखों में कोशिकाओं उद्धार ।
Abstract
ऐसे उंर से संबंधित धब्बेदार अध-पतन के रूप में अपक्षयी रेटिना रोगों (AMD) दुनिया भर में अपरिवर्तनीय दृष्टि हानि का प्रमुख कारण हैं । AMD रेटिना वर्णक उपकला (RPE) कोशिकाओं है, जो कार्यात्मकता कोशिकाओं का समर्थन और तंत्रिका रेटिना के आसपास लपेटन शारीरिक के एक monolayer रहे हैं के अध की विशेषता है. गैर के लिए वर्तमान औषधीय उपचार-neovascular amd (सूखी amd) केवल नीचे रोग प्रगति धीमी लेकिन दृष्टि बहाल नहीं कर सकते, महसूस उपंयास चिकित्सीय रणनीतियों की पहचान करने के उद्देश्य से अध्ययन । स्वस्थ कोशिकाओं के साथ अपक्षयी RPE कोशिकाओं की जगह भविष्य में शुष्क AMD के इलाज के लिए वादा रखती है । स्टेम सेल प्रतिस्थापन चिकित्सा AMD के लिए के व्यापक नैदानिक अध्ययन स्टेम सेल के पशु मॉडल के रेटिना अंतरिक्ष में RPE कोशिकाओं के प्रत्यारोपण शामिल है, जिसमें उप रेटिना इंजेक्शन तकनीक लागू किया जाता है । दृष्टिकोण सबसे अक्सर इन नैदानिक पशु अध्ययन में इस्तेमाल किया ट्रांस scleral मार्ग है, जो मुश्किल सुई अंत के प्रत्यक्ष दृश्य की कमी से बना है और अक्सर रेटिना क्षति में परिणाम कर सकते है के माध्यम से है । अवलेह के माध्यम से एक वैकल्पिक दृष्टिकोण सुई अंत स्थिति के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह अधिक आंख के ऊतकों के रूप में परेशान कर रहे हैं शल्य चिकित्सा आघात के एक उच्च जोखिम वहन करती है । हम एक कम जोखिम भरा और प्रतिलिपि संशोधित ट्रांस-scleral इंजेक्शन विधि है कि परिभाषित सुई कोण और गहराई का उपयोग करता है सफलतापूर्वक और लगातार चूहे रेटिना अंतरिक्ष में RPE कोशिकाओं को देने और अत्यधिक रेटिना क्षति से बचने के लिए विकसित किया है । इस तरीके से वितरित की कोशिकाओं को पहले से कम 2 महीने के लिए सर्जन (आरसी) चूहे के रॉयल कॉलेज में प्रभावोत्पादक होने का प्रदर्शन किया गया है । इस तकनीक का इस्तेमाल न केवल कोशिका प्रत्यारोपण के लिए बल्कि छोटे अणुओं या जीन उपचारों के वितरण के लिए भी किया जा सकता है ।
Introduction
मानव रेटिना एक प्रकाश संवेदी ऊतक के रूप में आंख के कार्यों के पीछे स्थित है और दृष्टि धारणा में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । रेटिना कोशिका रोग या कोशिका मृत्यु इसलिए दृष्टि समस्याओं या स्थायी अंधापन का कारण बनता है. पुनर्जनन या रेटिना के विभिन्न परतों में कोशिकाओं की शिथिलता को शामिल विकारों अपक्षयी रेटिना रोगों के रूप में जाना जाता है, जो बीच में AMD सबसे आम प्रकार है और विकसित देशों में बुजुर्ग में अपरिवर्तनीय अंधापन का प्रमुख कारण है 1,2. AMD के रोग प्रक्रिया RPE परत और अंतर्निहित Bruch की झिल्ली के बीच drusen “संचय” के साथ जुड़ा हुआ है, जो बारी में photoreceptor शरीर क्रिया विज्ञान की RPE समर्थन, तंत्रिका रेटिना शोष और दृष्टि हानि के लिए अग्रणी3, 4,5. इस प्रकार अब तक, वहां उंनत सूखी (गैर neovascular) AMD के लिए कोई इलाज नहीं है । reअपक्षय चिकित्सा में एक नए प्रतिमान के रूप में स्टेम सेल थेरेपी के उद्भव स्टेम सेल के साथ बेकार या मृत RPE कोशिकाओं की जगह की आशा लाता है स्वस्थ कोशिकाओं व्युत्पंन । दरअसल, स्टेम सेल के प्रत्यारोपण के व्यापक नैदानिक अध्ययन (जैसे, मानव भ्रूण स्टेम सेल)-RPE-अपक्षयी पशु मॉडल में व्युत्पंन RPE कोशिकाओं प्रदर्शन किया गया है6,7, जिनमें से कुछ के लिए प्रगति की है नैदानिक परीक्षण8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov) । हाल ही में, मानव RPE परत में निवासी स्टेम सेल के एक वैकल्पिक स्रोत, मानव RPE स्टेम सेल (hRPESCs), हमारी प्रयोगशाला द्वारा की पहचान की थी और वर्तमान में hRPESC व्युत्पंन के नैदानिक अध्ययन में इस्तेमाल किया जा रहा है-RPE सेल (hRPESC-RPE) AMD के लिए प्रत्यारोपण थेरेपी 10 , 11 , 12 , 13.
रेटिना इंजेक्शन तकनीक हमारे समूह सहित कई समूहों द्वारा उपर्युक्त नैदानिक अध्ययन में लागू किया जाता है । वहां दो जानवरों में रेटिना इंजेक्शन के लिए सामांय दृष्टिकोण हैं: ट्रांस vitreal और ट्रांस scleral । ट्रांस-vitreal दृष्टिकोण सर्जन के लाभ के लिए सीधे सुई अंत निरीक्षण के रूप में यह पूर्वकाल आंख में प्रवेश कर रहा है, पूरे vitreal लेंस से सटे गुहा पार, और आंख में वापस रेटिना में प्रवेश के लिए उप रेटिना तक पहुंचने के लिए रिक्ति14,15,16. हालांकि, यह दो स्थानों में रेटिना बाधित की आवश्यकता है (पूर्वकाल और पीछे), लेंस हानिकारक का खतरा वहन करती है, और अवलेह में कोशिकाओं की backflow में परिणाम कर सकते है जब सुई मुकर जाता है । इसके विपरीत, ट्रांस श्वेतपटल दृष्टिकोण, सिद्धांत रूप में, रेटिना और अवलेह की भागीदारी से बचा जाता है, और backflow आंख से बाहर निकालता है । pigmented कुतर में, सर्जन शुरू में श्वेतपटल के प्रवेश निरीक्षण कर सकते हैं, लेकिन pigmented धमनियां में पारित होने के बाद, सुई अंत नहीं दिख रहा है । प्रत्यक्ष अवलोकन के बिना, रेटिना का उल्लंघन आम है और रेटिना विच्छेदन और कोशिकाओं और/अवलेह में या रक्त की डिलीवरी में परिणाम कर सकते हैं । इसके अलावा, क्योंकि आंख की सतह घुमावदार है, यह पता करने के लिए बहुत मुश्किल है जो सुई कोण और गहराई ट्रांस scleral इंजेक्शन के लिए सबसे प्रभावी रहे हैं ।
इस visualized आलेख में, हम एक ट्रांस-scleral उप रेटिना इंजेक्शन विधि ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (OCT), जो इंजेक्शन साइट की एक विस्तृत परीक्षा की अनुमति देता है के साथ पोस्ट सर्जिकल मूल्यांकन के उपयोग द्वारा सूचित परिचय । हमारे ट्रांस-scleral इंजेक्शन तकनीक निर्धारित स्थानों, कोणों का इस्तेमाल करता है, और इंजेक्शन सुई के लिए गहराई बहुत कम शल्य चिकित्सा आघात और उच्च विश्वसनीयता का उत्पादन करने के लिए । यहां, हम विशेष रूप से hRPESC-RPE कोशिकाओं के इंजेक्शन आरसी चूहे, मानव AMD के एक पूर्व नैदानिक मॉडल के उपरेटिना अंतरिक्ष में प्रदर्शित करता है । इस इंजेक्शन विधि के साथ, हम सफलतापूर्वक और लगातार एक बहुत ही उच्च सफलता दर के साथ आरसी चूहे आंखों के उपरेटिना अंतरिक्ष में hRPESC-RPE कोशिकाओं को जंम दिया । कोशिकाओं के इंजेक्शन पहले आरसी photoreceptors के संरक्षण में परिणाम करने के लिए पाया गया था इंजेक्शन13के बाद कम 2 महीने. इस प्रक्रिया को विदारक माइक्रोस्कोप के तहत किया जाता है और सीखना आसान है । यह दो लोगों को (एक सर्जन और एक सहायक) की आवश्यकता है इंजेक्शन और प्रत्येक जानवर के लिए इंजेक्शन का औसत समय प्रदर्शन से कम 5 मिनट है । निर्धारित कोण और इंजेक्शन सुई के लिए गहराई यह प्रयोगशालाओं, जहां अक्टूबर उपलब्ध नहीं है के लिए संभव बनाने के लिए सफल उपरेटिना इंजेक्शन प्राप्त करने के लिए । यह अत्यधिक प्रतिलिपि रेटिना का उपयोग करने के लिए अनुमति देता है और न केवल सेल प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी दवा वितरण और जीन चिकित्सा के लिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस लेख में चित्रित उपरेटिना इंजेक्शन तकनीक ट्रांस scleral मार्ग है, जहां इंजेक्टर सुई तंत्रिका रेटिना को नुकसान पहुँचाए या अवलेह गुहा परेशान बिना आंख की दीवार के बाहरी परतों (श्वेतपटल-रंजित-RPE परिसर) प्रवे?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम RPE सेल तैयारी के लिए सर्जरी और सुसान बोर्डेन पर उसकी सहायता के लिए पैटी Lederman शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम भी इस परियोजना के लिए धन के लिए NYSTEM C028504 स्वीकार करते हैं । जस्टिन डी. मिलर को NIH ग्रांट F32EY025931 द्वारा सपोर्ट किया जाता है ।
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
References
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