Utvikling av en raffinert protokoll for Trans-Innbukking Subretinal transplantasjon av menneskelig netthinnens Pigment epitelceller i rotte øyne
Summary
Subretinal injeksjon er mye brukt i preklinisk studier av stilk cellen erstatning terapi for aldersrelatert makuladegenerasjon. I denne visualisert artikkelen beskriver vi en mindre risikabelt, reproduserbare og nøyaktig modifisert subretinal injeksjon teknikk via trans-Innbukking tilnærming til levere celler i rotte øyne.
Abstract
Degenerative retinal sykdommer som aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) er den ledende årsaken til irreversible synstap over hele verden. AMD er preget av degenerering av netthinnens pigment (RPE) epitelceller, som er en monolayer av celler funksjonelt støtte og anatomisk innpakning rundt neural netthinnen. Gjeldende farmakologiske behandlinger for ikke-neovascular AMD (tørr AMD) bare senke progresjonen av sykdommen, men kan ikke gjenopprette visjon, nødvendiggjør studier identifisere romanen strategier. Erstatter degenerative RPE cellene med friske celler har lov å behandle tørr AMD i fremtiden. Omfattende prekliniske studier av stilk cellen erstatning terapi for AMD innebære transplantasjon av Stamcelle-avledet RPE celler i subretinal plass dyr modeller, som subretinal injeksjon teknikken brukes. Fremgangsmåten som hyppigst brukes i disse prekliniske dyrestudier er gjennom trans-Innbukking ruten, som gjort vanskelig for direkte visualisering av nålen slutten og kan ofte føre retinal skade. En alternativ tilnærming gjennom linsen tillater direkte observasjon av p enden posisjon, men det bærer en høy risiko for kirurgiske traumer som mer øye vev er forstyrret. Vi har utviklet en mindre risikabelt og reproduserbar endret trans-Innbukking injeksjon metode som bruker definerte nål vinkler og dybder vellykket og konsekvent levere RPE celler i rotte subretinal plass og unngå overdreven retinal skade. Celler levert på denne måten har tidligere vist for å være effektiv i Royal College of Surgeons (RCS) rotta for 2 måneder. Denne teknikken kan brukes ikke bare for cellen transplantasjon, men også for levering av små molekyler eller gen-terapi.
Introduction
Human netthinnen ligger på baksiden av øyet funksjonene som en lys sensoriske vev og spiller en avgjørende rolle i visjon oppfatning. Netthinnen celle dysfunksjon eller celledød derfor forårsaker synsproblemer eller permanent blindhet. Lidelser som involverer degenerasjon eller dysfunksjon av celler i forskjellige lag av netthinnen som kalles degenerative retinal sykdommer, blant annet AMD er den vanligste typen og den ledende årsaken til irreversible blindhet hos eldre i utviklet land 1,2. Patologiske prosessen med AMD er forbundet med “drusen” akkumulering mellom RPE laget og underliggende Bruchs membran, som i sin tur svekker RPE støtte fra photoreceptor fysiologi, fører til nevrale Netthinne atrofi og visjonen tap3, 4,5. Så langt det er ingen kur for avanserte tørke (ikke neovascular) AMD. Fremveksten av stilk cellen terapi som et nytt paradigme i regenerativ medisin bringer håp om å erstatte dysfunksjonelle eller døde RPE cellene med Stamcelle-avledet friske celler. Faktisk omfattende prekliniske studier av transplanting stilk celler (f.eks, menneskelige embryonale stamcelleforskningen)-avledede RPE cellene i RPE-degenerative dyremodeller har vært utført6,7, hvorav noen har kommet til kliniske studier8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Nylig en alternativ kilde til stamceller bosatt i menneskelig RPE laget, menneskelige RPE stamceller (hRPESCs), ble identifisert av vår lab og brukes i preklinisk studier av hRPESC avledet-RPE (hRPESC-RPE)-cellen transplantasjon behandling for AMD 10 , 11 , 12 , 13.
Subretinal injeksjon teknikken brukes i preklinisk studiene nevnt av flere grupper, inkludert vår gruppe. Det er to generelle tilnærminger til subretinal injeksjon i dyr: trans-vitreal og trans-Innbukking. Trans-vitreal tilnærming har fordelen av kirurgen kunne direkte observere p enden som trenger fremre øyet, krysser hele vitreal hulrom tilstøtende linsen, og trenger netthinnen på baksiden for øyet å nå subretinal plass14,15,16. Det krever imidlertid forstyrre netthinnen på to steder (fremre og bakre), bærer risikoen for skade linsen, og kan medføre tilbakestrømming av celler i linsen når nålen er trukket. I kontrast, trans-sclera tilnærming, i prinsippet, unngår involvering av netthinnen og linsen, og tilbakestrømming avslutter øyet. I pigmentert gnagere, kirurgen kan først observere penetrasjon av sclera, men etter passering i pigmentert akkord, p enden er ikke lenger synlig. Uten direkte observasjon, brudd på netthinnen er vanlig og kan resultere i netthinnen disseksjon og leveringen av celler og/eller blod inn i linsen. Videre, fordi øyet overflaten er buet, er det svært vanskelig å vite hvilke nål vinkler og dybder er mest effektive for trans-Innbukking injeksjoner.
I denne visualisert artikkelen introduserer vi en trans-Innbukking subretinal injeksjon metode informert ved bruk av post-kirurgiske evalueringer med Optical Coherence tomografi (OCT), som gir en detaljert undersøkelse av injeksjonsstedet. Våre trans-Innbukking injeksjon teknikken bruker definerte steder, vinkler og dybder for injeksjon nåler til å produsere svært lav kirurgisk traumer og høy pålitelighet. Her viser vi spesielt injeksjon av hRPESC-RPE celler i subretinal plass av RCS rotte, en pre-klinisk modell av menneskelig AMD. Med denne injeksjon metoden levert vi vellykket og konsekvent hRPESC-RPE celler i subretinal løpet av RCS rotte øynene med en meget høy suksessrate. Injeksjon av celler ble tidligere funnet for å resultere i bevaring av RCS fotoreseptorer 2 måneder etter injeksjon13. Denne prosedyren utføres under dissecting mikroskopet og er lett å lære. Det krever to personer (en kirurg og en assistent) for å utføre injeksjon og Gjennomsnittstiden av injeksjon for hvert dyr er mindre enn 5 minutter. Den definerte vinkler og dybder for injeksjon nåler gjør det mulig for laboratorier, hvor OCT er utilgjengelig, å oppnå vellykket subretinal injeksjon. Det gir svært reproduserbar subretinal tilgang og kan brukes ikke bare for cellen transplantasjon, men også stoffet levering og gene terapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Subretinal injeksjon teknikken beskrevet i denne artikkelen er via trans-Innbukking veien, der injektor nålen trenger det ytterste lag (sclera-akkord-RPE komplekset) av øyet veggen uten skade neural netthinnen eller forstyrrer glasslegemet hulrom. En alternativ trans-vitreal tilnærming har en potensiell risiko linsen skade fører til katarakt, siden gnagere linsen opptar mesteparten av glasslegemet hulrom. Sammenlignet med denne metoden, våre teknikken er mindre risikabelt og forårsaker minimal traumer som injektor …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å takke Patty Lederman for henne hjelp på kirurgi og Susan Borden for RPE celle forberedelse. Vi erkjenner også NYSTEM C028504 for finansiering for dette prosjektet. Justine D. Miller støttes av NIH gi F32EY025931.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
References
- De Jong, P. T. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 355, 1474-1485 (2006).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ambati, J., Fowler, B. J. Mechanisms of agerelated macular degeneration. Neuron. 75, 26-39 (2012).
- Abdelsalam, A., Del Priore, L. V., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: Pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 358 (24), 2606-2617 (2008).
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Embryonic stem cells and retinal repair. Mech Dev. 124 (11-12), 807-829 (2007).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt’s macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Blenkinsop, T. A., et al. Human adult retinal pigment epithelial stem cell-derived RPE monolayers exhibit key physiological characteristics of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7085-7099 (2015).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
- Davis, J. R., et al. Human RPE Stem Cell-Derived RPE Preserves Photoreceptors in the Royal College of Surgeons Rat: Method for Quantifying the Area of Photoreceptor Sparing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 304-309 (2016).
- Westenskow, P. D., et al. Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension. J Vis Exp. (95), e52247 (2015).
- Lopez, R., et al. Transplanted Retinal Pigment Epithelium Modifies the Retinal Degeneration in the RCS Rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (3), 586-588 (1989).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Nair, G., et al. Effects of Common Anesthetics on Eye Movement and Electroretinogram. Doc Ophthalmol. 122 (3), 163-176 (2011).
- McGill, T. J., et al. Transplantation of human central nervous system stem cells – neuroprotection in retinal degeneration. Eur J Neurosci. 35, 468-477 (2012).
- Al-Hussaini, H., Kam, J. H., Vugler, A., Semo, M., Jeffery, G. Mature retinal pigment epithelium cells are retained in the cell cycle and proliferate in vivo. Mol Vis. 14, 1784-1791 (2008).
- Wang, S., Lu, B., Wood, P., Lund, R. D. Grafting of ARPE-19 and Schwann Cells to the Subretinal Space in RCS Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (7), 2552-2560 (2005).
- Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P. Induced corneal opacities in the rat. Br J Ophthalmol. 51 (2), 124-129 (1967).
