Utveckling av ett raffinerat protokoll för Trans-skleral Subretinal Transplantation av mänskliga Retinal Pigment epitelceller i råtta ögon
Summary
Subretinal injektion har tillämpats allmänt i prekliniska studier av stamceller substitutionsterapi för åldersrelaterad makuladegeneration. I denna visualiserade artikel beskriver vi ett mindre riskfyllt, reproducerbar och just modifierade subretinal injektionsteknik via trans-skleral strategi att leverera celler in råtta ögon.
Abstract
Degenerativa retinala sjukdomar såsom åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) är den vanligaste orsaken till irreversibel synnedsättning i hela världen. AMD kännetecknas av degeneration av retinal pigment epitel (RPE) celler, som är en enskiktslager av celler funktionellt stöd och anatomiskt omslag runt neurala näthinnan. Aktuella farmakologiska behandlingar för icke-neovaskulär AMD (torr AMD) bara sakta ner sjukdomsförloppet men kan inte återställa vision, vilket nödvändiggör studier syftar till att identifiera nya terapeutiska strategier. Ersätta de degenerativa RPE-cellerna med friska celler håller löfte att behandla torr AMD i framtiden. Omfattande prekliniska studier av stamceller ersätter behandlingar för AMD innebär transplantation av stamceller-derived RPE-celler i subretinalområdet av djurmodeller, som den subretinal injektionstekniken används. Metoden används oftast i dessa prekliniska Djurstudier är genom trans-skleral rutten, som försvåras av bristen på direkt visualisering av nålen slutet och kan ofta resultera i skada på näthinnan. Ett alternativt tillvägagångssätt genom glaskroppen möjliggör direkt observation av nålen slutpositionen, men det innebär en hög risk för kirurgiska trauman som mer ögats vävnader störs. Vi har utvecklat en mindre riskabelt och reproducerbara modifierade trans-skleral injektion metod som använder definierade nål vinklar och djup att framgångsrikt och konsekvent leverera RPE-celler i subretinalområdet råtta och undvika överdriven skada på näthinnan. Celler som levereras på detta sätt har tidigare visat sig vara effektiva i Royal College of Surgeons (RCS) råtta i minst 2 månader. Denna teknik kan användas inte bara för stamcellstransplantation, men också för leverans av små molekyler eller genterapi.
Introduction
Den mänskliga näthinnan sitter bakpå funktionerna ögat som ett ljus sensoriska vävnad och spelar en avgörande roll i vision perception. Retinal cellfunktion eller celldöd därför orsakar synproblem eller permanent blindhet. Störningar som involverar degeneration eller dysfunktion av celler i olika lager av näthinnan som kallas degenerativa retinala sjukdomar, bland vilka AMD är den vanligaste typen och den vanligaste orsaken till irreversibel blindhet hos äldre i utvecklade länder 1,2. Den patologiska processen av AMD associeras med ”drusen” ackumulering mellan RPE lagret och den underliggande Bruchs membran, som i sin tur försämrar RPE stöd av ljusmätare fysiologi, leder till neurala retinal atrofi och vision förlust3, 4,5. Hittills finns det ingen bot för avancerade torr (icke-neovaskulär) AMD. Uppkomsten av stamcellsterapi som ett nytt paradigm inom regenerativ medicin ger hopp om att ersätta de dysfunktionella eller döda RPE-cellerna med stamceller-derived friska celler. Faktiskt, omfattande prekliniska studier att transplantera stamceller (t.ex., mänskliga embryostamceller)-härledda RPE-celler i RPE-degenerativa djurmodeller har varit utförda6,7, varav vissa har nått kliniska prövningar8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Nyligen, en alternativ källa av stamceller som är bosatta i det mänskliga RPE lagret, de mänskliga RPE stamcellerna (hRPESCs), identifierades av vårt labb och används för närvarande i prekliniska studier av hRPESC härrör-RPE (hRPESC-RPE) transplantation cellterapi för AMD 10 , 11 , 12 , 13.
Den subretinal injektionstekniken används i de prekliniska studierna ovan av flera grupper, inklusive vår grupp. Det finns två generella metoder subretinal injektionsvätska i djur: trans-vitreal och trans-skleral. Den trans-vitreal metoden har fördelen att kirurgen att kunna direkt observera nål slutet som den tränger främre ögat, korsar hela vitreal hålrummet intill linsen och tränger på näthinnan baktill i ögat att nå subretinala utrymme14,15,16. Det kräver dock störa näthinnan på två platser (främre och bakre), bär risken för skador på linsen, och kan resultera i återflödet av celler i glaskroppen när nålen är indraget. Däremot metoden trans-sklera, i princip undviker inblandning av näthinnan och glaskroppen, och återflödet lämnar ögat. I pigmenterad gnagare, kirurgen kan initialt Observera genomträngningen av sklera, men efter passagen i pigmenterad åderhinnan, nål slutet är inte längre synlig. Utan direkt observation, bryter mot näthinnan är vanligt och kan resultera i näthinnans dissektion och leverans av celler eller blod i glaskroppen. Dessutom eftersom ögats yta är böjda, är det mycket svårt att veta vilka kanyl vinklar och djupet är mest effektiva för trans-skleral injektioner.
I denna visualiserade artikel introducerar vi en trans-skleral subretinal injektion metod informerade genom användning av postoperativa utvärderingar med optisk koherenstomografi (OCT), vilket gör att en detaljerad granskning av injektionsstället. Våra trans-skleral injektionsteknik använder tredjeparts definierade platser, vinklar och djup för injektionsnålar att producera mycket låg kirurgiskt trauma och hög tillförlitlighet. Här visar vi specifikt injektionen av hRPESC-RPE-celler i subretinalområdet RCS råttans, en preklinisk modell av mänskliga AMD. Med denna injektion metod levererat vi framgångsrikt och konsekvent hRPESC-RPE-celler i subretinalområdet av RCS råtta ögon med en väldigt hög framgång. Injektion av celler befanns tidigare resultera i bevarandet av RCS fotoreceptorer minst 2 månader efter injektion13. Denna procedur utförs under mikroskopet dissekera och är lätt att lära. Det krävs två personer (en kirurg och en assistent) för att utföra injektionen och den genomsnittliga tiden för injektion för varje djur är mindre än 5 minuter. De definierade vinklar och djup för injektionsnålar gör det möjligt för laboratorier, där OCT är tillgänglig, att uppnå framgångsrika subretinal injektion. Den möjliggör mycket reproducerbara subretinal tillgång och kan användas inte bara för stamcellstransplantation, men också för leverans och gen läkemedelsbehandlingar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den subretinal injektionsteknik som skildras i denna artikel är via trans-skleral vägen, där injektionsnålen penetrerar de yttre skikten (sklera-åderhinnan-RPE complex) av ögat väggen utan att skada neurala näthinnan eller störande glaskroppsrummet. Alternativa trans-vitreal tillvägagångssätt har en potentiell risk för objektiv skador leder till katarakt, eftersom gnagare lins upptar huvuddelen av glaskroppsrummet. Jämfört med denna metod, vår teknik är mindre riskabelt och orsakar minimal trauma som inj…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Patty Lederman för hennes hjälp på kirurgi och Susan Borden för RPE cell beredning. Vi erkänner också NYSTEM C028504 för finansieringen av detta projekt. Justine D. Miller stöds av NIH bevilja F32EY025931.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
References
- De Jong, P. T. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 355, 1474-1485 (2006).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ambati, J., Fowler, B. J. Mechanisms of agerelated macular degeneration. Neuron. 75, 26-39 (2012).
- Abdelsalam, A., Del Priore, L. V., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: Pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 358 (24), 2606-2617 (2008).
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Embryonic stem cells and retinal repair. Mech Dev. 124 (11-12), 807-829 (2007).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt’s macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Blenkinsop, T. A., et al. Human adult retinal pigment epithelial stem cell-derived RPE monolayers exhibit key physiological characteristics of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7085-7099 (2015).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
- Davis, J. R., et al. Human RPE Stem Cell-Derived RPE Preserves Photoreceptors in the Royal College of Surgeons Rat: Method for Quantifying the Area of Photoreceptor Sparing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 304-309 (2016).
- Westenskow, P. D., et al. Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension. J Vis Exp. (95), e52247 (2015).
- Lopez, R., et al. Transplanted Retinal Pigment Epithelium Modifies the Retinal Degeneration in the RCS Rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (3), 586-588 (1989).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Nair, G., et al. Effects of Common Anesthetics on Eye Movement and Electroretinogram. Doc Ophthalmol. 122 (3), 163-176 (2011).
- McGill, T. J., et al. Transplantation of human central nervous system stem cells – neuroprotection in retinal degeneration. Eur J Neurosci. 35, 468-477 (2012).
- Al-Hussaini, H., Kam, J. H., Vugler, A., Semo, M., Jeffery, G. Mature retinal pigment epithelium cells are retained in the cell cycle and proliferate in vivo. Mol Vis. 14, 1784-1791 (2008).
- Wang, S., Lu, B., Wood, P., Lund, R. D. Grafting of ARPE-19 and Schwann Cells to the Subretinal Space in RCS Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (7), 2552-2560 (2005).
- Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P. Induced corneal opacities in the rat. Br J Ophthalmol. 51 (2), 124-129 (1967).
