Introduction
Lungene er i løpende kontakt med det ytre miljøet og er sterkt utsatt for både ufarlige partikler og mikrober med kapasitet til å forårsake sykdom. Derfor er det kritisk for immunsystemet å feste potente immunresponser mot invaderende patogener, men det er like viktig å opprettholde toleranse til inhalerte antigener som ikke forårsaker sykdom. For å gi potent immunovervåkning, er i luftveiene foret med et nettverk av immunceller, inkludert dendrittiske celler (DCS). DC er profesjonell antigen-presenterende celler med den unike evne til å aktivere naive T-celler. I menneskelige lunger, bosatt DCs møter et antigen og deretter prosessen og transportere den til lunge-drenering lymfeknuter for presentasjon til og aktivering av T-celler 1, 2, 3.
I det humane immunsystem, kan DC deles inn i flere undergrupper, med Distinct men overlappende funksjoner: CD1c + og CD141 + myeloide DC (MDCs) og CD123 + plasmacytoid DC (PDCs) 4, 5. Mens de fleste detaljert kunnskap om menneskets DC stammer fra studier i blodet, er det nå klart at den menneskelige lungene også havn sjeldne populasjoner av DC undergrupper med T-celle stimulerende kapasitet 6, 7, 8, 9. Men samler data viser at immunceller, inkludert DC, ulik frekvens, fenotype, og funksjon avhengig av deres anatomiske plassering 10. Derfor er det viktig å studere immunceller fra det aktuelle vev for å forstå deres bidrag til lokal immunitet og toleranse. Tatt sammen, understreker dette behovet for å studere lunge-resident DC når adressering lungesykdommer, til tross for blod DCs blir lettere tilgjengelig og tilgjengelig hos mennesker.
De første studier som undersøkte lunge-resident DC hos mennesker først og fremst avhengig av morfologi og ekspresjon av enkelte markører, slik som HLA-DR og CD11c, i vevssnitt ved hjelp av immunhistokjemi 11, 12, 13. I motsetning til flere nyere studier har vanligvis stolt på flowcytometrisk analyser for å studere ulike immunceller undergrupper. Imidlertid, siden det er vanskelig å finne en enkelt celleoverflate markør som identifiserer en bestemt DC undergruppe, potensialet begrensning av studier anvende bare fire-fargers flowcytometri er risiko for blant annet cellepopulasjoner med liknende fenotypiske markører som DCS. For eksempel er CD11c uttrykk på alle myeloide DC og det store flertallet av monocytter. På den annen side, i studier anvende mer avanserte strømningscytometri paneler, ble ikke-kreft lungevev fra kirurgiske resections av pasienter som typisk anvendesxref "> 10, 14, 15, 16, selv om det er uklart om disse sjeldne bestandene er virkelig representativ for DC til stede hos friske personer. Totalt studier er begrenset i stor grad på grunn av det faktum at kirurgisk fjernet eller hele menneske lungevev er knappe.
For å overvinne noen av disse begrensningene, beskriver dette arbeidet hvordan du utfører en detaljert analyse av romlige fordeling og en fenotypisk identifisering av DC i slimhinne endobronchial biopsier hentet fra friske frivillige som gjennomgår en bronkoskopi. Flere små biopsier kan hentes fra hver enkelt og kan deretter bygges for seksjonering og analyse ved hjelp av immunhistokjemi eller enzymatisk fordøyd for avansert flowcytometrisk analyse. Ved hjelp av lungevev i form av endobronchial biopsier erholdt fra bronchoscopies confers fordelen av å gjøre det mulig å utføre den stUdy på friske frivillige, i motsetning til åpen kirurgi i lungene som, av åpenbare grunner, er begrenset til pasienter som krever thoraxkirurgi. Videre er vev som er samplet i løpet av en bronkoskopi fra friske frivillige er fysiologisk normale, i motsetning til en ikke-påvirkede området i lungevevet hos pasienter med pulmonal sykdom. På den annen side, biopsier er små, og antall celler som er hentet, selv når sammenslåing flere biopsier, begrenser den type analyser som kan utføres.
Selv om foreliggende arbeid fokuserer på DC, til metodene beskrevet direkte kan utvides omfatte andre (immun) celler av interesse som finnes i humant mucosal lungevev. Videre protokollene er også direkte anvendelig til prøver oppnådd fra pasienter som lider av pulmonale sykdommer hvor bronkoskopi er en del av etablering av diagnosen, slik som kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), sarkoidose, eller lungekreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Denne forskningen ble godkjent av regional etisk Review Board i Umeå, Sverige.
1. Bronkoskopi for Sampling Endobronchial Biopsi fra bilder av mennesker
- Innhente informert samtykke fra alle deltakere.
- Unn pasienter med oral midazolam (4-8 mg) og intravenøs glykopyrroniumbromid (0,2 til 04 mg) 30 min før bronkoskopi. Påfør aktuell anestesi med lidokain i strupehodet og bronkiene. La emnet gurglevann med ~ 3 ml lidokain 4% og anvende 3 ml til tungen bunnen og inn i larynx via en strupehode sprøyte. Optimalisere aktuelle anestesi med 8-10 doser av lidokain spray. Utfør dette trinnet med faget sittende.
- Sett en fleksibel video bronchoscope gjennom munnen via en plastmunnstykke med motivet i liggende stilling. Bruke en spesiallaget spray kateter for å fullføre topisk bedøvelse av den fjerne luftrøret og bronkiene via bronkoskop. Her bruker en dose på ca.5-10 ml lidokain 2%.
- Ta 6-9 endobronchial slimhinne biopsier fra hoved carina og hoved bronkial divisjonene bruker fenestrert tang (figur 1). Etter bronkoskopi og før du forlater sykehuset, la temaet hvile i 2-4 timer og gi ham / henne med et lett måltid.
2. Embedding Biopsi i Glycol metylakrylat (GMA) Resin
MERK: GMA farging protokollen ble opprinnelig utviklet ved Southampton University, histokjemi Research Unit 17.
- Feste: For immunhistokjemi, fjerne biopsier fra tang og plassere dem direkte inn i hetteglass som inneholder 3 ml iskald dehydrert aceton og proteasehemmere (fenylmetylsulfonylfluorid (35 mg / 100 ml aceton) og iodoacetamide (370 mg / 100 ml aceton )). Fest vev over natten ved -20 ° C (figur 2).
MERK: Følgende trinn skal PERFORMED i et avtrekksskap med passende nitrilhansker. Den embedding Settet inneholder komponenter som kan gi allergi, irritasjon og / eller allergiske hudreaksjoner. Alt avfall skal behandles som farlig avfall. - Dehydrering: Fjern aceton med hemmere og erstatte med frisk dehydrert aceton (uten hemmere) i 15 minutter ved romtemperatur (RT). Ta av aceton og erstatte den med metyl benzoat i 15 min.
- Infiltrasjon: Forbered en behandlingsløsning på 5% metyl benzoat løsning i glykol metakrylatmonomer; 10 ml er tilstrekkelig for en hetteglass. Ved hjelp av plast Pasteur pipetter, suging av metyl benzoat løsning og erstatte med 3 ml behandling løsning. Inkuber biopsier og overskudd av behandlingsløsning ved 4 ° C i 2 timer; Pasteur pipetter kan brukes for alle etterfølgende endringer løsning, blant annet innebygging løsning.
- Utveksle behandlingsløsningen hver 2 time (3x 2 timers inkubasjon), slik at den totale infiltrasjon tiden av biopsies i behandlingsløsningen er minst 6 timer. Sett papiretiketter i den øverste enden av innebygging kapsler for å identifisere biopsier.
- Forbered en embedding løsning av 75 mg benzoylperoksid i 10 ml glykol metakrylatmonomer. Legg 0,25 ml N, N-dimetylanilin poly (etylenoksid) (akselerator) til den innebygging oppløsningen for å starte polymerisasjonsreaksjonen. Fjern behandling løsning og plassere en biopsi i den aktuelle embedding kapsel med tang.
- Sakte fylle den innebygging kapselen til toppen med innebygging oppløsning og lukke lokket. Unngå å forstyrre biopsi og skaper store luftbobler. Inkuber kapslene ved 4 ° C inntil harpiksen er fullstendig polymerisert.
- Lagre de innleirede biopsier ved -20 ° C i et 50 ml rør inneholdende ca. 5 g silikagel.
3. Seksjonering av GMA-integrerte Endobronchial Biopsi
- Objektglass belegg: Vask objektglass i enoppvaskmaskin på en normal syklus. Dekk lysbildene og la dem lufttørke.
- Fremstille en beleggløsning på 10% poly-L-lysin (PLL) oppløsning i destillert vann. Senk lysbildene i belegget løsningen for 5 min, og deretter la dem lufttørke. Lagres tørt PLL-belagt lysbilder i originalemballasjen.
- Vask ark glassbånd med 0,1% Tween 20 i destillert vann. Skyll glasset med 70% etanol og tørr med tørkepapir. Skjær glassblad mot glasslisten med en kniv maker. Oppbevar bladene i en container som hindrer bevegelse for å sikre at eggen ikke blir skadet eller bretter.
- Biopsi trimming: Plasser biopsi kapsel i en kapsel splitter og kutte ned på hver side ved hjelp av en karbon-stål single-edge blad. Fjern GMA-embedded biopsi og sett den fast i en skrustikke. Trim overflødig GMA fra hele biopsi med stål blad.
- GMA seksjonering.
- Forbered 0,05% ammoniakkløsning med destillert vann. Plasser glass kniv og biopsi i the mikrotom. rettes opp biopsi blokken med bladet ved å justere knivholderen og vinkelen for biopsi blokken slik at bladet hviler flatt mot overflaten av blokken.
- Klipp 2 mikrometer tykke seksjoner ved hjelp av mikrotom på en langsom skjærehastighet og bruke pinsett til å overføre og flyte ut deler på ammoniakk vann. Flyt seksjonene for 45-90 sek, slik at milde antigen gjenfinning og utfoldelse av seksjonen.
- Plukk opp seksjoner med objektglass. Sjekk biopsi histologi ved raskt farging med toluidin blå.
- Tørk glir på en varm plate satt til 50 ° C og anvende 500 ul filtrert toluidin blå flekk til en seksjon ved hjelp av en plast Pasteur pipette. Varm seksjonen på kokeplate til en grønn ring begynner å dukke opp på kanten av flekken, og deretter vaske det av med vann.
- Ved hjelp av et lysmikroskop, sjekk biopsi histologi. Seksjoner som brukes for immunhistokjemi bør inneholde gode områder av uskadet laminapropria og epitel, med så få kjertler og så lite glatt muskulatur som mulig.
- Som i avsnitt 3.4.2, klippet som har god histologi og plukke dem opp med PLL-belagte objektglass for immunhistokjemisk farging. Kuttes i det minste to seksjoner fra hver biopsi for analyse. Tørr lysbilder i minst 1 time. Etter tørking kan seksjonene være innpakket i aluminiumsfolie og lagret ved -20 ° C i opp til 2 uker, eller de kan være umiddelbart immunfarget.
4. Immunhistokjemisk Farging av GMA-integrerte Endobronchial Biopsi
MERK: Natriumazid er giftig. Klargjør 0,1% natriumazid løsning innenfor et avtrekksskap og vekk fra syrer. Ved kontakt med syre utvikles giftig gass.
- Tegn rundt delene med en diamant-tipped penn og ordne lysbilder mot en farging rack.
- Utfør en Peroxidase blokk. Fremstille en peroksidase blokk løsning av 0,3% hydrogenperoksyd i 0,1% natriumazid oppløsning. Apply 1 ml av peroksidase blokken til seksjoner og inkuber i 30 min.
- Fremstille en vaskeoppløsning av 0,05 M Tris-bufret saltvann (TBS), pH 7,6. Vask lysbildene i TBS, 3x 5 min.
- Forbered en BSA blokk løsning i DMEM 1%. Gjør dette på forhånd og i store volumer, delmengde og fryse den inntil nødvendig. Drain lysbildene og inkuber seksjonene i blokk løsning i 30 min for å blokkere uspesifikk antistoff binding. Hvis uspesifikk binding vedvarer, omfatte en 30 min inkubasjon trinn med 5% serum blokk fra samme art som det sekundære antistoff.
- Fortynnet primært antistoff (CD45 eller CD1a) i TBS til ønsket konsentrasjon (CD45 fortynnet til 1: 1000; CD1a fortynnet til 1: 1,00) og bruke den til lysbilder. Dekk seksjonene og inkuber natten ved RT.
- Vask lysbilder i TBS tre ganger. Fortynn biotinylert sekundært antistoff (rettet mot de primære antistoff vertsart, i dette tilfellet kanin anti-mus F (ab '2)) i TBS til den ønskede konsentrasjon (01:300 fortynning) og bruke den til lysbilder. Inkuber i 2 timer ved RT.
- Forbered en streptavidin biotin-peroksidase kompleks minst 30 min før bruk. Sørg for at det er nok til å dekke alle lysbilder. Vask lysbildene i TBS tre ganger. Påfør løsningen på lysbildene og inkuberes i 2 timer ved RT.
- Vask lysbildene i TBS tre ganger. Forbered 3-amino-9-etylkarbazol (AEC) peroxydasesubstrat løsning (laget i henhold til produsentens instruksjoner). Bruk den til lysbildene og inkuberes i 20-30 min eller til ønsket flekken intensitet utvikler seg.
- Skyll lysbildene i rennende vann i 5 min. Counterstain seksjonene med filtrert Mayers haematoksylin-løsning i 2 minutter. Vask lysbildene i rennende vann i 5 min.
- Drain lysbildene og dekke deler med permanent vandig montering medium. Tørk lysbilder på 80 ° C i en tørkeovn. Tillat lysbildene avkjøles, og deretter montere dem med DPX og plassere en dekkglass.
5. Stinnelukker Analysis
- Analyser seksjonene ved 40X forstørrelse ved hjelp av et lysmikroskop med en montert kamera som er koblet til en datamaskin.
MERK: For cellular analyse, telle positivt farget, med kjerne cellene i bronkial lamina propria og intakt epitel, med unntak av områder av glatt muskulatur, kjertler, store blodårer, og feilaktige eller skadet vev. - Gjennomsnittlig celletall og korrigere den gjennomsnittlige celletall for det området av lamina propria og lengden av epitel. Arealet av lamina propria og lengden av epitel kan beregnes ved hjelp av et bildeanalyseprogram.
6. Enzymatisk spalting av Endobronchial Biopsi
- Oppvask biopsier: Ved hjelp av sterile pinsetter, sted intakte biopsier i et 15 ml konisk rør inneholdende 10 ml Hanks bufret saltløsning (HBSS) (figur 3). Inkuberes i 5 minutter ved romtemperatur på en gyngende plattform ved 30 rpm. Overfør biopsier til et sterilt dish ved dekantering av innholdet i 15 ml rør med HBSS.
- Forstyrre slim med DTT: Bytt HBSS i røret med 10 ml HBSS inneholder 5 mM 1,4-ditiotreitol (DTT). Overfør biopsier tilbake i 15 ml tube bruker steril tang. Inkuber i 15 minutter ved romtemperatur på en gyngende plattform ved 30 rpm.
- Vortex røret forsiktig i 15 sek. Overfør biopsier på en steril tallerken ved dekantering av innholdet i 15 ml rør med HBSS og DTT.
- Overføring av biopsier til kultur medium: Bytt HBSS og DTT i røret med 10 ml RPMI 1640 dyrkingsmedium. Overfør biopsier tilbake i 15 ml tube bruker steril tang. Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur på en gyngende plattform ved 30 rpm.
- Bearbeider biopsier med collagenase og DNase.
- Fremstille en fordøyelse oppløsning av kollagenase II (0,25 mg / ml) og DNase (0,2 mg / ml) i forvarmet RPMI inneholdende 1 M HEPES-løsning. Legg 500 mL av fordøyelsen løsning per brønn i en 48-brønners kulture plate.
- Plasser en biopsi per brønn i fordøyelsen løsning. Platen inkuberes på en risteplattform i 60 minutter ved 37 ° C ved 220 rpm. Pipetter opp og ned etter 30 min for å re-dispergere biopsier, og etter 60 min, for å fullstendig disaggregert vevet.
- Forbereder enkeltcellesuspensjoner.
- Basseng sammen fordøyd biopsier fra brønnene i et 50 ml rør ved å føre det gjennom en 40 um celle sil. Samle de gjenværende cellene ved vasking av brønnene med iskald FACS-buffer (fosfat-buffret saltvann (PBS) inneholdende 2% føtalt bovint serum).
- Klem den gjenværende vev på cellefilter ved hjelp av baksiden av stempelet i en sprøyte. Sentrifuger fordøyd cellene ved 400 xg i 5 min ved 4 ° C. fjern supernatanten forsiktig og resuspender pelleten i 5 ml iskald FACS-buffer. Tell cellene manuelt ved hjelp av et hemocytometer og Trypan blå flekk for å vurdere levedyktigheten av cellene.
- Resuspender cellepelleten til omtrent 1 x 10 6 celler i 200 ul FACS-buffer.
- Legg en celle levedyktighet fargestoff for død celle utelukkelse i henhold til produsentens protokoll.
- Tilsett 5 mL av FcR blokkering reagens og inkuberes i 5 minutter ved 4 ° C.
- Legg celleoverflate antistoffer mot CD45 (2 ul), avstamning (CD3, CD20, CD56, CD66abce, og CD14; 2 mL hver), CD16 (0,5 ul), HLA-DR (3 mL), CD11c (5 ul), CD123 (5 ul), CD1c (3 ul), og CD103 (2 mL) og inkuberes i 15 min ved 4 ° C. Detaljer på antistoffer kan finnes i metodedelen, men titrere og optimalisere antistoffene til den nøyaktige strømningscytometer i bruk. Vask av overskytende antistoffer med PBS i 5 minutter ved 400 x g. Acquire prøvene frisk på et flowcytometer eller fikse cellene i 1% paraformaldehyde før senere acquisition.
- Identifisere humane DC i lunge biopsi ved anvendelse av en strømningscytometri-analyse 18 (figur 4).
MERK: Ved hjelp av en flowcytometri analyse programvare, er immunceller skilles fra andre lungeceller ved gating på CD45. Døde celler kan utelukkes som celler som er positive for LIVE / DEAD fargestoff. Av alle levende CD45 + celler, avstamning celler (B-celler, T-celler, NK-celler, nøytrofile og monocytter) kan utelukkes ved hjelp av en cocktail av antistoffer mot CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14, og CD16 i en kanal. Etter at HLA-DR + celler vil tillate identifisering av alle menneskelige DC. MDCs kan skilles fra PDCs basert på ekspresjonen av CD11c eller mangel på CD11c, respektivt. MDCs kan videre deles inn i CD1c + MDCs eller CD141 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Studier som karakteriserer menneske respiratoriske vev-resident immunceller, inkludert DC, er begrenset, hovedsakelig på grunn av det faktum at kirurgisk fjernet eller hele menneske lungevev er knappe. Her er en mindre invasiv metode for å skaffe lungevev fra endobronchial biopsier (EBB) hos friske frivillige og utviklet protokoller for å studere immunceller i vev ved hjelp av immunhistokjemi eller flowcytometri skissert.
Friske frivillige gjennomgikk bronkoskopi, som tidligere beskrevet 19 20. Seks til ni 1-2 mm 3 endobronchial slimhinne biopsier ble tatt fra hoved carina og de viktigste bronkial divisjoner av hvert fag ved hjelp fenestrert tang (figur 1A). To biopsier ble innebygd i GMA og senere brukes til immunhistokjemi å gi romlig informasjon. De resterende biopsies ble enzymatisk spaltet, og de enkeltcellesuspensjoner ble analysert ved hjelp av multi-farge flowcytometri, som tillot nøye karakterisering av sjeldne celleundergrupper (figur 1B).
For å oppnå så mye romlig informasjon som mulig fra de små vev stykker, ble biopsier innleiret i GMA som gjør det mulig for ultratynne um seksjoner (figur 2A-B). Som forventet, CD45-uttrykke immunceller var relativt sjeldne i gjennomsnitt 125 CD45 + celler per mm 2 var tilstede i slimhinnene lungevevet under steady-state, som vurdert av immunhistokjemi (figur 2C). LgG1-isotype-kontroll resulterte ikke i noen positiv farging, noe som indikerer høy spesifisitet av det primære antistoff. Antallet positive celler i både lungeepitelet og den underliggende lamina propria ble kvantifisert og viste at CD45 + immunceller var mer rikelig i lamina propria enn i epitelet (figur 2D). Videre ble CD1a-uttrykkende celler identifisert og nummerert, og de mest sannsynlig representerer DC (figur 2E). I gjennomsnitt var mindre enn en CD1a + celle per mm2 identifisert i lungen lamina propria ved stabil tilstand (figur 2F).
Immunhistokjemi gir informasjon om den anatomiske fordelingen av celler i intakt vev, men det er vanligvis begrenset i sin evne til å definere celler ved hjelp av flere celleoverflatemarkører. Flerfarge flowcytometri, avhengig av instrumentet, har fordelen av å gi mer informasjon pr celle, og det kan anvendes i små prøver. Opp til ni slimhinnelunge biopsier ble samlet, vasket, og inkubert for å forstyrre slim. Hver biopsi ble deretter spaltet med kollagenase og DNase i individuelle brønner i en 48 godt plate, noe som resulterer i en enkeltcellesuspensjon (Figures 3A - 3B). I gjennomsnitt ble 1,5 x 10 6 endobronchial celler per emne innhentet, og en positiv sammenheng mellom celleutbytte og levedyktighet ble observert (Figur 3C). Den reduserte cellelevedyktighet observeres med lavere celleantall potensielt kan forklares ved en høyere enzymkonsentrasjon per celle som var suboptimal for cellene. Dette er en utfordring med biopsier varierende både i størrelse og i celletetthet, med noen biopsier prøvetaking mer av den overflatiske slimhinnen enn andre. Som forventet, flowcytometrisk analyse av enkeltcellesuspensjonen viste at, i gjennomsnitt 12% av cellene var CD45 + leukocytter, mens de fleste av cellene i lungeslimhinnevevet under steady state betingelser ikke var immune celler (figur 3D ). Den flowcytometrisk og IHC data korrelert, som fremhever styrken i å bruke begge teknikker parallelt.
+ leukocytter som uttrykte HLA-DR, men var negative for de avstamning markører CD3, CD20, CD56, CD66abce, CD14, og CD16 (figur 4A). I denne lille populasjon av celler, ble plasmacytoid DC (PDCs) identifisert basert på deres mangel på CD11c uttrykk og deres høye uttrykk for CD123 og HLA-DR (blågrønn). Blant de CD11c + HLA-DR + avstamning-negative celler, både CD1c + (koraller) og CD141 + (rødbrun) myeloide DC ble identifisert (figur 4A). For ytterligere å karakterisere disse celle undergrupper, deres ekspresjon av integrin CD10 3 som binder seg til E-cadherin, viktig i vev forankrings, ble evaluert. Mens alle DC undergrupper, så vel som T-celler som sirkulerer i perifert blod, var lav eller negativ for CD103, uttrykt en tydelig andel av DCS og T-celler som finnes i lungene til det samme individ CD103. Dette var sant for celler som finnes både i bronkoalveolær lavage så vel som i lungevevet (figur 4B).
Figur 1: Prøvetaking av human lunge slimhinnevevet. (A) Bronchoscopies ble utført på fag for å få endobronchial biopsier fra de viktigste bronkial divisjoner av en lunge ved hjelp av tang. (B) Biopsi ble enten innebygd i GMA for vev seksjonering og immunhistokjemi (blå diagram) eller enzymatisk fordøyd å få encellede suspensjoner for flowcytometri (rosa diagram).m / filer / ftp_upload / 55222 / 55222fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Inkludering biopsier i GMA harpiks. (A) Biopsier tatt fra bronchoscopies ble umiddelbart overført til hetteglass som inneholder iskald dehydrert aceton (venstre panel). Etter fiksering over natten, ble biopsier infiltrert med metylbenzoat løsning. Biopsier ble plassert i embedding kapsler fylt med embedding løsning til å begynne polymerisasjon (midtre panelet). Innebygde biopsier kan oppbevares ved -20 ° C, eller kan være seksjonert for immunhistokjemi farging (høyre panel). (B) Den skjematiske høydepunkter viktige skritt i prosessen med embedding biopsier bruker GMA. Representative bilder av seksjonert biopsier viser tilstedeværelse av CD45 + (C) eller CD1a + -celler (E) er vist i forhold til de respektive isotype kontrollene (høyre panel). Spesifikk farging er vist i rødt, og cellekjerner kontra med hematoksylin er i blått. Scale bar = 50 mikrometer. Søylediagrammer viser median ± interkvartile spekter av CD45 + (D) eller CD1a + (F) celler per mm 2 epitel eller lamina propria (n = 20). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Enzymatisk spalting av biopsier for strømningscytometri. (A) En endobronchial biopsi tatt fra en bronkoskopi i en petriskål. Biopsiene ble vasket i HBSS, ble behandlet med DTT for å fjerne slim, end spaltet med kollagenase og DNase forut for samling av enkeltceller for flowcytometrisk analyse. (B) Skjematisk oppsummerer hovedfremgangsmåter for å spalte biopsier for strømningscytometri. (C) Grafen viser korrelasjonen i celle-utbytte og levedyktighet, som vurdert ved manuell telling og Trypan blå eksklusjon (n = 20). (D) Single-cellesuspensjoner fra fordøyd biopsi ble analysert ved flowcytometri og vurderes for levedyktighet og uttrykk for CD45 (leukocytter felles antigen). Flowcytometri plott viser et representativt donor av 20 friske personer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Identifikasjon av lunge dendrittiske celler undergrupper i fordøyd biopsies. (A) gating strategi for identifisering av CD1c + og CD141 + myeloide DC (MDCs) og plasmacytoid DC (PDCs) i lungeslimhinnevevet. Flowcytometri plott fra en representant gjenstand vises. (B) prikkplotter viser uttrykk for inte CD103 på bestander av DC i lunge biopsi (venstre panel), bronchoalveolar kylling (midtre panelet), og perifert blod (høyre panel). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen beskriver hvordan du generere en detaljert romlig og fenotypisk karakterisering av lungevevet bosatt DC hos friske mennesker bruker immunhistokjemi og flowcytometri på endobronchial slimhinnebiopsi samlet inn under bronkoskopi. I de følgende avsnittene kritiske trinn i protokollen blir diskutert i detalj.
Kritiske trinn med protokollen
Seksjonering og immunhistokjemi: Det er viktig å holde biopsi blokkene ved -20 ° C når det ikke bruker dem (trinn 2.5). Varm blokker kan noen ganger bli myk og vil ikke delen også. I tillegg vil holde blokkene ved -20 ° C bevare antigen områder og resultere i bedre farging ved hjelp av immunhistokjemi.
Seksjonering og immunhistokjemi: Når seksjonering de GMA-integrerte biopsier, er det praktisk å ha 3-4 beholdere av ammoniakk vann tilgjengelig til å flyte avsnittene om. Når en seksjon er plukket opp, make sikker på å erstatte den med en ny seksjon (trinn 3.4). Dette sikrer at, etter den tid den delen håndteres igjen, vil det ha vært flytende på ammoniakk vann i omtrent riktig lengde på tid (45-90 sek), som hjelpemidler i antigen presentasjon og den påfølgende immunhistokjemi. Cutting 2 um seksjoner på denne måte gir også mulighet for etterfølgende snitte, noe som betyr at den samme celle kan potensielt bli farget med forskjellige celleoverflate eller intracellulære markører. Det er viktig å ikke røre forkant av glasset bladet når seksjonering, som det er lett skadet. Hvis det er noen rester fra det blad som skal fjernes, alltid børste bort fra skjæreeggen.
Enzymatisk fordøyelse og strømningscytometri: I vevsprøver hvor immunceller er sjelden, er det avgjørende å inkludere CD45 i strømnings farging panelet først identifisere leukocytter (i mindretall) før ytterligere identifisere DC eller andre immunceller av interesse. Også "fluorescence minus én "eller isotype kontroller er avgjørende for å inkludere under validering antistoff paneler som brukes for å sikre at sjeldne hendelser er sant signal over støy.
Modifikasjoner og feilsøking
Seksjonering og immunhistokjemi: For de fleste cellulære markører som uttrykkes av celler i immunsystemet kan tonsil vev brukes som en god positiv kontroll og for å titrere antistoffer for immunhistokjemi for å unngå å kaste bort begrenset endobronchial biopsimateriale (trinn 4). For å visualisere de dendrittiske prosesser av DC, kan vev seksjoneres parallelt med epitel, i stedet for vinkelrett gjennom mukosa 21. Andre peroksydasesubstrater kan brukes i tillegg til AEC, slik som DAB, hvis brukeren krever et annet substrat farge. Avidin / biotin-enzymkompleks kan også være substituert, for eksempel med alkalisk fosfatase.
Enzymatisk fordøyelse og strømningscytometri: Selv om det endobronchial biopsier er små, vev-hørende celler overlever den enzymatiske fordøyelse og prosessering i en enkeltcellesuspensjon for flowcytometrisk analyse (Figur 3). Imidlertid er det viktig å vurdere den potensielle virkningen av enzymene på flekker som brukes i flowcytometri antistoffet panel. For å teste om de enzymatisk fordøyelse protokoll kløyver av, endrer eller forstyrrer antistoff flekker, lettere tilgjengelig celler som uttrykker lignende markører, slik som perifere mononukleære blodceller, kan behandles med fordøyelsesenzymer (trinn 6) eller ikke, og de kan senere av farget med fluorescensmerkede antistoffer og analysert ved flowcytometri (trinn 7). Dersom kollagenase og DNase ikke interfererer med antigenet tilgjengelighet, bør flekker med eller uten behandling av cellene med enzymene ser like ut. Videre kan dette kontrolleres ved hjelp av begge flowcytometri, samt intakt vevssnitt og immunhistokjemi (Fitallene 2 - 3) 19.
Begrensninger av teknikken
Bronkoskopi: De fleste friske mennesker tåler en bronkoskopi godt, og det er en metode som rutinemessig brukes til å undersøke og smake på lungene, herunder å samle endobronchial slimhinnebiopsi, som beskrevet her (trinn 1). Imidlertid er bronkoskopi vanligvis ikke er en egnet metode for å utføre for langsgående sampling, siden det ofte oppleves som ubehagelig, og det er også en tid- og ressurskrevende prosedyre. Derfor endobronchial biopsier gir bare et øyeblikksbilde av immunceller tilstede i mucosal lungevevet på et gitt tidspunkt, heller enn en langtidsstudie av endringer i dynamikk eller kinetikk.
Betydningen av Technique For eksisterende / alternative metoder
Seksjonering og immunhistokjemi: Fordelen med å bygge i GMA heller enn parafin eller ved nedfrysinger den overlegne konservering av morfologi og antigener, og større antall seksjoner fra de små biopsier, på grunn av de tynne seksjoner som kan oppnås 17.
Enzymatisk fordøyelse og flowcytometri. Ved å skaffe enkeltceller fra små biopsier, kan mye mer informasjon oppnås ved multi-color flowcytometri.
Fremtidige søknader eller Veibeskrivelse Etter å mestre denne teknikken
Denne protokollen beskrevet to parallelle fremgangsmåter for å maksimere informasjonen som fås fra små endobronchial biopsier ved å kombinere immunhistokjemi og flowcytometri. For å karakterisere romlig fordeling av sjeldne immunceller, slik som DCS, biopsier kan bygges inn i GMA for å oppnå tynne snitt for immunohistokjemi, mens det for å skille DC fra andre immunceller med tilsvarende markører, den enzymatiske fordøyelse av biopsiene tillater flerfarge flowcytometri å være performed. For å aktivere objektiv identifisering av nye egenskapene til DC under betennelse eller sykdom, kan den automatisk analyse av strømningscytometriske data utføres ved å bruke funksjonen utvinning algoritmer 22. Fremtidige bruksområder er ved hjelp av disse enkeltceller for celle sortering for å samle inn spesifikke cellepopulasjoner som kan brukes for RNA sekvensering eller transcriptomic profilering. Identifiseringen av DC bosatt i lungene kan være viktig for å forstå endringer i immun landskapet under helse og sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke de frivillige som har bidratt klinisk materiale til denne undersøkelsen. Vi er også takknemlig til de ansatte ved Institutt for samfunnsmedisinske klinisk medisin, Seksjon for medisin / Respiratory Medicine, universitetssykehus, Umeå (Norrlands universitetssjukhus) for innsamling av all klinisk materiale.
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til AS-S fra Vetenskapsrådet, den svenske Hjerte-Lunge Foundation, den svenske Stiftelsen for strategisk forskning, og Karolinska Institutet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchoscopy | |||
| Bronchoscope BF1T160 | Olympus | BF1T160 | |
| Light source | Olympus | Exera CV-160 | |
| Fenestrated forceps | Olympus | FB21C | Used to take biopsies |
| Bite Block | Conmed | 1429 | 20 mm x 27 mm |
| Glucose 25% | 500 ml intravenous | ||
| Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml | Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion | ||
| Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o | Can be used for extra relaxation | ||
| Lidocaine, 40 mg/ml | Mouth and throat administration / Gargled | ||
| Lidocaine 100 mg/ml spray | Administered to back of throat | ||
| Lidocaine 20 mg/ml spray | Administered via bronchoscope to airways | ||
| GMA processing and embedding | |||
| Glass vials | 5 ml | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
| Molecular sieves, 4 Å | Alfa Aesar | 88120 | 3-4 mm diameter pellets |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0.035 g/100 ml acetone |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0.37 g/100 ml acetone |
| Polythene-flat TAAB embedding capsules | TAAB laboratories | C094 | 500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules |
| Capsule holder | TAAB laboratories | C054 | Holds 25 8 mm capsules |
| JB-4 GMA embedding kit | Polysciences | 00226 | Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12) |
| Methyl benzoate | Sigma-Aldrich | 27614-1L | |
| Silica gel with humidity indicator | Scharlau | GE0043 | 2.5-6 mm |
| GMA sectioning | |||
| Glass microscope slides | ThermoFisher Scientific | 10143562CEF | Cut edges, frosted end |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 1:10 for working solution |
| Sheet glass strips for ultramicrotomy | Alkar | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Wash solution (0.1% Tween20) |
| LKB 7800B Knifemaker | LKB | ||
| Capsule splitter | TAAB laboratories | C065 | |
| Carbon steel single edge blades | TAAB laboratories | B054 | |
| Vice | |||
| Ammonia, 25% | VWR | 1133.1000 | 2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%) |
| Microtome | Leica | Leica RM 2165 | |
| Light source | Leica | Leica CLS 150 XE | |
| Microscope with swing arm stand | Leica | Leica MZ6 | |
| GMA Immunohistochemistry | |||
| Diamond tipped pen | Histolab | 5218 | |
| Hydrogen peroxide 30% solution | AnalaR Normapur | 23619.264 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Tris | Roche | 10708976001 | |
| Sodium chloride | VWR chemicals | 27810.295 | |
| Bovine serum albumin | Millipore | 82-045-2 | Probumin BSA diagnostic grade |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Anti-human CD45 antibody | BioLegend | 304002 | Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml |
| Anti-human CD1a antibody | AbD Serotech | MCA80GA | Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml |
| Mouse monoclonal IgG1 isotype control | Abcam | ab27479 | |
| Mouse monoclonal IgG2a isotype control | Dako | X094301-2 | |
| Vectastain ABC Elite standard kit | Vector Labs | PK-6100 | |
| AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite | Vector Labs | SK-4200 | |
| Mayers haematoxylin | HistoLab | 01820 | |
| Permanent Aqueous Mounting Medium | AbD Serotech | BUF058C | |
| Drying oven | |||
| DPX permanent mounting solution | VWR | 360292F | |
| Light microscope | Leica | Leica DMLB | |
| Microscope camera | Leica | Leica DFC 320 | |
| Analysis software | Leica | Leica Qwin V3 | |
| Enzymatic digestion | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | 55021C | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Forceps | |||
| Platform rocker | Grant instruments | PMR-30 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Flow cytometry | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit | Life Technologies | L34957 | |
| CD45 | BD | 555485 | |
| CD3 | BD | 557757 | |
| CD20 | BD | 335829 | |
| CD56 | Biolegend | 318332 | |
| CD66abce | Miltenyi | 130-101-132 | |
| HLA-DR | BD | 555813 | |
| CD14 | BD | 557831 | |
| CD16 | Biolegend | 302026 | |
| CD11c | BD | 560369 | |
| CD1c | Miltenyi | 130-098-009 | |
| CD141 | Miltenyi | 130-090-514 | |
| CD103 | Biolegend | 350212 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| LSR II Flow cytometer | BD | Flow cytometer | |
| FlowJo | FlowJo | Software for analysis | |
References
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).
- Lambrecht, B. N., Hammad, H. Biology of lung dendritic cells at the origin of asthma. Immunity. 31 (3), 412-424 (2009).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
- Demedts, I. K., Brusselle, G. G., Vermaelen, K. Y., Pauwels, R. A. Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (3), 177-184 (2005).
- Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D. Identification rare-event detection and analysis of dendritic cell subsets in broncho-alveolar lavage fluid and peripheral blood by flow cytometry. Front Biosci. 8, s1175-s1180 (2003).
- Masten, B. J., et al. Characterization of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in human lung. J Immunol. 177 (11), 7784-7793 (2006).
- Ten Berge, B., et al. A novel method for isolating dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 351 (1-2), 13-23 (2009).
- Yu, C. I., et al. Human CD1c+ dendritic cells drive the differentiation of CD103+ CD8+ mucosal effector T cells via the cytokine TGF-beta. Immunity. 38 (4), 818-830 (2013).
- Nicod, L. P., Lipscomb, M. F., Toews, G. B., Weissler, J. C. Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence. J Leukoc Biol. 45 (5), 458-465 (1989).
- Sertl, K., et al. Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura. J Exp Med. 163 (2), 436-451 (1986).
- van Haarst, J. M., de Wit, H. J., Drexhage, H. A., Hoogsteden, H. C. Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 10 (5), 487-492 (1994).
- Schlitzer, A., et al. IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses. Immunity. 38 (5), 970-983 (2013).
- Yu, Y. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
- Haniffa, M., et al. Human tissues contain CD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells. Immunity. 37 (1), 60-73 (2012).
- Britten, K. M., Howarth, P. H., Roche, W. R. Immunohistochemistry on resin sections: a comparison of resin embedding techniques for small mucosal biopsies. Biotech Histochem. 68 (5), 271-280 (1993).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Baharom, F., et al. Dendritic Cells and Monocytes with Distinct Inflammatory Responses Reside in Lung Mucosa of Healthy Humans. J Immunol. 196 (11), 4498-4509 (2016).
- Salvi, S., et al. Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers. Am J Respir Crit Care Med. 159 (3), 702-709 (1999).
- Schon-Hegrad, M. A., Oliver, J., McMenamin, P. G., Holt, P. G. Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)-bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways. J Exp Med. 173 (6), 1345-1356 (1991).
- Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).
