Афалин (Tursiops truncatus) Дельфин сперматозоидов: сбор, криоконсервация и гетерологичных В экстракорпорального оплодотворения
Summary
Здесь мы представляем протоколы, которые успешно использовались для сбора сперматозоидов Дельфин, криоконсервация и гетерологичных эко производительности с помощью бычьего ооцитов.
Abstract
Использование Дельфин Криоконсервированные сперматозоидов облегчает обмен генетического материала между водных парков и делает доступными для лаборатории для исследования для дальнейшего понимания воспроизводства морских млекопитающих сперматозоидов. Гетерологичных Эко, замена для гомологичных Эко, может служить средством для тестирования фертильности спермы потенциал; Изучение физиологии гамет и раннего развития эмбрионов; и чтобы избежать использования ценных Дельфин ооцитов, которые трудно получить. Здесь мы представляем протоколы, которые были успешно использованы для сбора и криоконсервировать Дельфин сперматозоидов. Коллекция спермы производится ручной стимуляции на подготовленных дельфинов. Криоконсервация осуществляется с помощью медиаприставки трис-желток яйца на основе с глицерином. Кроме того мы представляем протокол, который описывает гетерологичных ЭКО с использованием Дельфин сперматозоидов и говядину ооцитов и что проверяет гибридный характер полученный эмбрион с помощью ПЦР. Гетерологичных оплодотворение поднимает вопросы на оплодотворение и может использоваться в качестве инструмента для изучения физиологии гамет и раннего эмбрионального развития. Кроме того успех гетерологичных эко демонстрирует потенциал этой техники для тестирования Дельфин спермы подкормки потенциала, который заслуживает дальнейшего изучения.
Introduction
Вспомогательные репродуктивные технологии слабо развиты в диких животных, включая морских млекопитающих. Отсутствие чувствительных методов оценки спермы подкормка успех способствует медленного развития репродуктивных технологий в таких видов, как дельфин. Он не был до недавнего времени основные параметры семенных афалины (Tursiops truncatus) были сообщил1,2. Однако такие переменные, как подвижность и морфологии, хотя широко используется, дают ограниченную информацию о репродуктивной эффективности. Лучшим показателем качества спермы является оценка возможностей внесения удобрений.
Недавно наша группа используется метод для оценки Дельфин спермы подкормки потенциал путем оценки мужской pronuclear формирования и/или гибридных формирование эмбриона после гетерологичных ЭКО с использованием zona нетронутыми говядину ооцитов3. Использование Дельфин говядину гетерологичных эко имеет важные преимущества над гомологичных Эко, как он преодолевает трудности получения Дельфин ооцитов и облегчает использование систем испытанный в vitro говядину яйцеклетка созревания. Во избежание видов специфика гетерологичных оплодотворение обычно выполняется в отсутствие ZP. Хотя это позволяет для оценки способности отреагировали Акросома сперматозоидов предохранитель с vitelline мембраной, он повреждает оценки других функций, связанных с оплодотворения. Процедура, описанная использует zona нетронутыми ооцитов и позволяет оценку следующих параметров: спермы zona привязки и привязанности, проникновения, polyspermy, pronuclear формирования и гибридные расщепления эмбрионов.
Здесь мы представляем несколько протоколов для сбора семени, анализ основных спермы, замораживание сперматозоидов, а также оценки Дельфин спермы функциональность путем оценки мужской pronuclear и/или гибридных формирование эмбриона после гетерологичных ЭКО с использованием zona нетронутыми говядину ооцитов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для многих различных видов млекопитающих есть разнообразные преимущества использования деконсервированных спермы. К ним относятся возможность передачи ценный генетический материал, потенциал для распространения во всем мире, низкий риск загрязнения и возможность сохранения мужски…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
его работа финансировалась министерством экономики и конкурентоспособности (AGL2015-70140-R для D. Rizos), AGL2015-66145R A. Гутьеррес-Адан и J. F. Перес-Гутьеррес и Сенека фонд Мурсия (20040 Грант/ЗАРОДЫШЕЙ/16 до F. Гарсия-Васкес)
Materials
| FERT-TALP medium | Merck | |
| TCM-199 | Sigma | M-4530 |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 |
| 4-well dishes | Nunc | 176740 |
| Density gradient BoviPure | Nidacon International | BP-100 |
| Washing solution Boviwash | Nidacon International | BW-100 |
| Magnesium chloride | Promega | A35 1H |
| Sterile water | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H |
| Buffer Tris Borate EDTA | Sigma | T4415 |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| 5X GoTaq flexi buffer | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| Taq polymerase | Promega | |
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A |
| Makler counting chamber | Sefi Medical | |
| Thoma chamber | Hecht-Assistant | |
| pHmeter MicropH 2000 | Crison Instruments | |
| Osmometer Advanced micro osmometer 3300 | Norwood | |
| Computer assisted sperm analysis system | Projectes y Serveis R+D | |
| Stereomicroscope MZ 95 | Leica | |
| Epifluorescent optics Eclipse Te300 | Nikon | |
| Confocal assistant 4.02 software | Bio-Rad | 3D analysis software |
| Confocal laser scanning microscopy | Bio-Rad | |
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Gilson | |
| Microcentrifuge tubes | VWR | |
| UV iluminator | Bio-Rad | |
| PCR Thermal cycler Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
References
- Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
- Keller, K. V. Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination. IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).
- Robeck, T. R., O’brien, J. K. Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).
- Coy, P., et al. Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow. Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).
- Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).
- Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
- Sánchez-Calabuig, M. J., et al. Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).
- Robeck, T. R., et al. Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).
- Robeck, T. R., et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).
- Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
- Madeddu, M., et al. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen. Anim Reprod Sci. , (2016).
