कवक के माध्यम से रैपिड विलोपन उत्पादन<em> एग्रोबैक्टीरियम</em> OSCAR विलोम कन्स्ट्रक्शंस के मध्यस्थ परिवर्तन
Summary
मुताबिक पुनर्संयोजन के माध्यम से उत्पन्न जीन विलोपन म्यूटेंट जीन फ़ंक्शन अध्ययन के लिए स्वर्ण मानक हैं। ओएससीएआर (एक चरण निर्माण एग्रोबैक्टेरिअम-पुनर्संयोजन-तैयार-प्लास्मिड) का निर्माण, शीघ्र ही विलोपन निर्माण के लिए तैयार किया गया है। एग्रोबैक्टेरिअम मध्यस्थता वाले कवक परिवर्तन निम्न प्रकार है। अंत में, फिंगल ट्रांसफार्मेंट में जीन विलोपन के एक पीसीआर आधारित पुष्टिकरण विधि प्रस्तुत की जाती है।
Abstract
ब्याज की जीन (एस) का सटीक विलोपन, शेष जीनोम को अपरिवर्तित छोड़ते समय, जीवित जीव में विशेष जीन के कार्य को निर्धारित करने के लिए आदर्श उत्पाद प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल में सटीक और तेजी से विलोपन प्लाज्मिड निर्माण की ओएससीएआर पद्धति का वर्णन किया गया है। ओएससीएआर क्लोनिंग सिस्टम पर निर्भर करता है जिसमें एक रिंकंबनीज प्रतिक्रिया होती है जिसमें शुद्ध पीसीआर-प्रवर्धित 5 'और 3' ब्याज के जीन और दो प्लास्मिड, पीए-हाइग ओएससीएआर (मार्कर वेक्टर) और पॉसैर (विधानसभा वेक्टर)। सही ढंग से इकट्ठे हटाए जाने वाले वेक्टर की पुष्टिकरण क्रमिक पाचन मैपिंग द्वारा क्रमिक द्वारा पीछा किया जाता है। एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफाइन्स का उपयोग फंगल स्पार्स (एटीएमटी के रूप में संदर्भित) में विलोपन के निर्माण की मध्यस्थता के लिए किया जाता है। अंत में, एक पीसीआर परख को यह निर्धारित करने के लिए वर्णित किया गया है कि क्या विलोपन का निर्माण समरूप या गैर-मुताबिक पुनर्संयोजन द्वारा एकीकृत है, जीन विलोपन का संकेत याएक्टोपिक एकीकरण, क्रमशः। वर्टिकिलियम डाहलिया में कई जीनों को हटाने और अन्य प्रजातियों के बीच फ़ुसरियम वर्टिसिलियइड में इस दृष्टिकोण का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है।
Introduction
आनुवंशिक विच्छेदन व्यक्ति या संयोजन के जीनों के कार्यात्मक महत्व को निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली पद्धति है। विशिष्ट जीनों की भूमिका को समझने के लिए एक मानक दृष्टिकोण किसी अन्य जीन में अनियंत्रित एकल जीन म्यूटेंट का उत्पादन होता है। किसी भी अन्य जीन फ़ंक्शन को नुकसान किए बिना ब्याज के खुले पढ़ने वाले फ्रेम (जीओआई ओआरएफ) के जीन का सबसे शक्तिशाली और कम से कम संभावित रूप से भ्रामक दृष्टिकोण पूर्ण और सटीक विलोपन है।
चूंकि प्लाज्मिड पीढ़ी को हटाने के लिए मानक ढक्कन दृष्टिकोण कई कदमों की आवश्यकता है, ओएससीएआर 1 के लिए तर्कसंगत विट्रो दृष्टिकोण में अधिक तेजी से उत्पादन करना था। चित्रा 1 में OSCAR दृष्टिकोण में विधानसभा प्रक्रिया को दर्शाया गया है। यहां वर्णित विधि में एक एकल बहुपंक्ति प्रतिक्रिया में व्यक्तिगत जीन विलोपन वाले वैक्टर के तेजी से निर्माण के संयोजन का फायदा है, इसके बाद के एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफाइन्स मध्यस्थ ट्रांसपोर्सेजरेमेशन (एटीएमटी) ओएससीएआर बहुत तेजी से है और खमीर 2 में गिब्सन विधानसभा के उपयोग जैसे अन्य रणनीतियों के साथ तुलना करता है। ओएससीएआर विधि कई सफलतापूर्वक कवक के असम्कोकोटा प्रजातियों के साथ प्रयोग की गई है। इन प्रजातियों में शामिल हैं: Fusarium verticillioides (अप्रकाशित), वर्टिकिलियम डाहलिया 3 , सैटसोफियारिया टर्कािका 4 , मेटारिज़ियम रॉबर्टि 5 , फ़्युसरियम ऑक्सीसोरम्म एफ। sp। Vasinfectum 6 , पेस्टलोटियप्स माइक्रोसॉरा 7 , कोलेटोट्रिचिम हिग्गिंसियानम 8 , और डोथिस्ट्रोमा सेप्टोसॉम्रम 9 और सरोकालेडियम जुए (अप्रकाशित) ।
यह प्रोटोकॉल प्राइमर डिजाइन, पार्श्व पीसीआर प्रवर्धन, ओएससीएआर बीपी प्रतिक्रिया, विलोपन निर्माण संरचना की पुष्टि, ट्रांसफार्ममेंट सहित विधि के लिए चरण-दर-चरण अनुदेश प्रदान करता हैनिर्माण के साथ एग्रोबेक्टेरियम का आयन एटीएमटी आधारित हस्तांतरण के बाद फंगल कोशिकाओं में खुलता है, और अंततः एक्टोपिकी एकीकृत विलोपन निर्माण वाले उन लोगों से कवक हटाने मिटंट्स को विभेदित करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक चरण एग्रोबेक्टेरियम का निर्माण- पुनर्संयोजन-तैयार-प्लास्मिड (ओएससीएआर) को सफलतापूर्वक एक असम्कोकोटा कवक की बढ़ती संख्या के साथ नियोजित किया गया है। एसिबैक्टेरीयम मध्यस्थता परिवर्तन और मुताब…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने निम्नलिखित स्नातक और उच्च विद्यालय के छात्रों को अपने काम के लिए Fusarium verticillioiodes में ओएससीएआर म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए धन्यवाद : अंजेलिका मिलर, अथर नसीर, झू लिन, केटलिन वुडब्र्री, चेल्सी पैटरसन, कैथलीन रॉबर्टसन, क्रिस्टिना ब्राडली, एशटन रोजर्स, एलेक्सिस मैकेन्सी, मैन्नी हर्नांडेज़ , अशली क्रेप्सैक, जेफ डेलाग, क्रिश्चियन किंग, गि जोंग, मारिया बेल्डिंग, क्रिस्टी बुरे, डैनियल ओमेरा, लॉरेन (विक्टोरिया) कुक, जेक गुडमैन, संप्रती डी, ओगे ओकॉय, एलिसा बेकस्टेड, गेटेट हिब्स, निक गोल्डस्टीन, कैरोलिन ट्विम , क्रिस बेन्सन, लुई स्टोक्स, हन्ना इटेल, जेन हल्स, जासीम मोहम्मद, जेम्स लॉगगिन्स, केल्ली रसेल, ग्रेनीना जोन्स, क्रिस्टिन शेफ़र, मरीयम हम्मानी, एवा विल्सन, कैटरीना बजेमोरे, टनी हार्पर, कार्लिन मैकही, मोहम्मद मोमीन, रीमा मोमीन , थी नोगोक ले और एंजेल फम
Materials
| FungiDB | Database/ http://fungidb.org/fungidb/ | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | Sequence file manipulation | ||
| Low Na LB Spec 100 medium | E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5 % agar if for solid medium | ||
| Co-cultivation medium | ATMT transformation induction (Reference 12) | ||
| Aspergillus minimal medium with Hygromycin | Fungal transformant selection | ||
| PDA medium | Acumedia | 7149A | Single spore slant tubes |
| PDA-Hyg-Kan medium | Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/ml hygromycin B and 100 μg/ml Kanamycin; | ||
| Glass beads | Genlantis | C400100 | Plate spreading |
| Nitrocellulose filters (47mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-culturing for ATMT |
| Various centifuge tubes | multiple preps | ||
| Petri plates (various) | Culturing of bacteria and Fungi | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Selectable marker vector |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | Assembly vector |
| DH5a One Shot Competent E. coli cells | Life Technologies | 12297-016 | BP reaction transformation |
| ccdB survival E. coli cells | Life Technologies | A10460 | Maintenance of pOSCAR |
| Wooden transfer sticks | Colony streaking | ||
| Toothpicks | Colony picking | ||
| Microcentrifuge | Pelleting Bacteria etc | ||
| Preparative centrifuge | Fungal spore collection | ||
| Dissecting microscope | Single spore isolation | ||
| Automated Cell Counter | Spore suspension calculation | ||
| Compound microscope | Hemocytometer cell counting | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR gene flank produict purification |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation |
| Hygromycin B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Spectinomycin | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxim | TCI America | C2224 | |
| Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Post staining agarose gels |
| Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Used to assemble deletion construct in pOSAR |
| PrimerQuest tool | IDT | Used in step 1.4; available on http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
References
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