Analyse av kromosomsegregasjon, histonacetylering og spindelmorfologi i hesteokocytter
Summary
Dette manuskriptet beskriver en eksperimentell tilnærming til morfologisk og biokjemisk karakterisering av hesteocytter. Spesifikt illustrerer foreliggende arbeid hvordan å samle umodne og modne hesteocytter ved ultralydstyrt ovumopptak (OPU) og hvordan undersøke kromosomsegmentering, spindelmorfologi, global histonacetylering og mRNA-ekspresjon.
Abstract
Feltet assistert reproduksjon er utviklet for å behandle infertilitet hos kvinner, følgesvenner og truede arter. I hesten muliggjør assistert reproduksjon også produksjon av embryoer fra høyt utøvere uten å forstyrre sin idrettskarriere og bidrar til en økning i antall føll fra marer av høy genetisk verdi. Det nåværende manuskriptet beskriver prosedyrene som brukes for å samle umodne og modne oocytter fra hestestokkene ved å bruke ovum pickup (OPU). Disse oocytene ble deretter brukt til å undersøke forekomsten av aneuploidi ved å tilpasse en protokoll som tidligere ble utviklet hos mus. Spesielt ble kromosomer og sentromerer av metafase II (MII) oocytter merket fluorescens og talt på sekventielle fokalplaner etter konfokal lasermikroskop-skanning. Denne analysen viste en høyere forekomst i aneuploiditetsfrekvensen når umodne oocytter ble samlet fra folliklene og modnet in vitro sammenlignet medIn vivo. Immunostaining for tubulin og den acetylerte formen av histon 4 ved spesifikke lysinrester viste også forskjeller i den meotiske spindelens morfologi og i det globale mønsteret av histonacetylering. Endelig ble ekspresjonen av mRNA som koder for histon-deacetylaser (HDACs) og acetyltransferaser (HATs) undersøkt ved revers transkripsjon og kvantitativ PCR (q-PCR). Ingen forskjeller i det relative uttrykket av transkripsjoner ble observert mellom in vitro og in vivo modnet oocytter. I samsvar med en generell stumning av transkripsjonsaktiviteten under oocytmodning, kan analysen av total transkripsjonsmengde bare avsløre mRNA-stabilitet eller nedbrytning. Derfor viser disse funnene at andre oversettelses- og posttranslatoriske forskrifter kan bli påvirket.
Samlet beskriver den foreliggende studien en eksperimentell tilnærming til morfologisk og biokjemisk karakterisering av hesten oocyt, en ceLl skrive som er ekstremt utfordrende å studere på grunn av lav tilgjengelighet tilgjengelighet. Det kan imidlertid utvide vår kunnskap om reproduktiv biologi og infertilitet i monovulatoriske arter.
Introduction
Et stort utvalg av assisterte reproduksjonsteknikker har blitt utviklet for å behandle infertilitet hos kvinner, følgesvenner og truede arter. En av de vanligste prosedyrene i kliniske innstillinger er gjenvinning av metafase II (MII) -stadieocytter fra eggstokkfollikler ved ultralydstyrt transvaginal aspirasjon, oppsamling av egg (OPU) 1 . Disse oocytene blir deretter befruktet in vitro (IVF), med det resulterende embryoet (e) implantert i en mottaker uterus. MII-trinnet (modne) oocytter hentes etter administrering av eksogene gonadotropiner. Imidlertid er denne behandlingen forbundet, hos noen pasienter, med utviklingen av ovarial hyperstimuleringssyndrom (OHSS) 2 .
Å dra nytte av den indre evne til fullvokst, umodne oocytter (GV-stadium) for spontant å gjenoppta meiosis en gang isolert fra deres follikler, er det mulig å oppnå modne oocytter uten administrasjonToning gonadotropin 3 . Denne prosedyren kalles oocyte in vitro modning (IVM) og representerer en mindre narkotikarelatert, billigere og mer pasientvennlig tilnærming til assistert reproduktiv teknologi. Suksessen med embryoutvikling med in vitro- matede oocytter er imidlertid generelt lavere enn med in vivo- modne oocytter 4 , 5 . En mulig forklaring er at in vitro- modne oocytter påvirkes mer av feil i kromosomsegregasjon, og den resulterende aneuploidien forringer normal embryonisk utvikling 6 .
Å forstå den molekylære basisen for kromosomal mis-segregering under IVM, vil i siste instans avsløre det fulle potensialet i denne teknikken. I denne vene brukte den eksperimentelle tilnærmingen til å undersøke de morfologiske og biokjemiske egenskapene til in vitro- matede oocytter sammenlignet med in vivo matEd oocytter er her beskrevet 7 , 8 . Spesielt er prosedyrene for OPU av umodne og modne oocytter og IVM av umodne oocytter illustrert ved hjelp av voksne og naturlig sykler som en eksperimentell modell. Deretter brukes immunfluorescens og bildeanalyse for å undersøke kromosomsegmentering, spindelmorfologi og det globale mønsteret av histonacetylering på disse gametene. Endelig er en protokoll for revers-transkripsjon og kvantitativ PCR beskrevet for analysen av mRNA-ekspresjon.
Sammenlignet med gnagerdyrmodeller, tillater ikke hester genetisk manipulering, er det mindre lett å manipulere, og krever dyrt vedlikehold. Imidlertid får denne modellen stor interesse for studiet av oocytmodning 9 , 10 på grunn av likheten til menneskelig ovariefysiologi 11 , 12 </ Sup>. Videre har utviklingen av pålitelige protokoller for IVM-IVF i hesten en betydelig økonomisk interesse, da det ville muliggjøre en økning i antall føll fra marer av høy genetisk verdi.
En av begrensningene for å utføre eksperimenter på oocytter, spesielt i monovulatoriske arter, er begrenset prøve tilgjengelighet. Denne grensen er overvunnet her ved å justere en tilnærming, tidligere utviklet hos mus, til hestocytene 13 , 14 for å utføre kromosometelling som minimerer prøveutfallet (se diskusjonen for en sammenligning med andre tilgjengelige teknikker). Videre er en trippel-fluorescensfargingsprotokoll optimalisert for å utføre flere analyser på samme prøve, og q-PCR-analyser ble utført bare på bassenger med 2 oocytter.
Samlet beskriver den foreliggende studien en eksperimentell tilnærming rettet mot morfologisk og biokjemisk chaRacterize hesten oocyte, en celle type som er ekstremt utfordrende å studere på grunn av lav tilgjengelighet tilgjengelighet. Det kan imidlertid utvide vår kunnskap om reproduktiv biologi og infertilitet av monovulatory arter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om IVM har blitt utført på hester i mer enn 20 år 16 , vet vi ennå ikke om oocyten kan være opprinnelsen til embryonal aneuploidi, som det har blitt foreslått for mennesker 17 . Årsaken er sannsynligvis at utarbeidelsen av oocyt-sprøyter for kromosometelling resulterer i betydelig prøveforsinkelse. Med dette i bakhodet ble en undersøkelse av metodene som ble brukt for å undersøke feil i kromosomsegregasjon, utført for å søke etter den mest hensiktsmessi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Fabrice Vincent for støtte med laserskanningskonokalsmikroskopi (LSCM) , og Philippe Barrière og Thierry Blard for å utføre daglig ultralyd ovariescanning og hCG-injeksjon. Dette arbeidet ble støttet delvis av "Regione Sardegna og Regione Lombardia" -projektet "Ex Ovo Omnia" (Tilskudd nr. 26096200 til AML); "L'Oreal Italia per le Donne e la Scienza 2012" fellesskap (Kontrakt 2012 til FF), FP7-PEOPLE-2011- CIG, Forskningsforvaltningsorganet (REA) "Pro-Ovum" (stipend nr. 303640 til VL); Og av Postdoktorskolen for jordbruk og veterinærmedisin, medfinansiert av Det europeiske sosialfond, Sektorielt operativt program for menneskelig ressursutvikling 2007-2013 (Kontrakt nr. POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 til IM). In vivo oocyt samlingen ble finansiert av Institut Français du Cheval et de l'Equitation.
Materials
| ultrasound probe | Aloka | UST-5820-7,5 | |
| human chorionic gonadotrophin | centravet | CHO004 | 1500unit/animal IV |
| detomidine | centravet | MED010 | 9-15µg/kg IV |
| butylscopolamine bromure | centravet | EST001 | 0,2mg/kg IV |
| stereomicroscope | NIKON | SMZ-2B | |
| butorphanol | centravet | DOL003 | 10µg/kg IV |
| benzyl-penicillin | centravet | DEP203 IM | 15000UI/animal |
| TCM199 | Sigma-Aldrich | M3769 10X1L | powder for hepes-buffered TCM199 |
| Hepes sodium salt | Sigma-Aldrich | H3784-100G | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| NaHCO3-buffered TCM199 | Sigma-Aldrich | M2154-500ML | liquid for IVM medium |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| newborn calf serum | Sigma-Aldrich | N4762-500ML | |
| 4-well dishes | NUNCLON | 144444 | |
| incubator | Heraeus | BB6060 | |
| monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
| triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232 | BioLegend | 636102 | |
| TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | 711-025-152 | |
| Vecta-Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YOPRO1 | Thermofisher Scientific | Y3603 | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 780 | Zeiss | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 700 | Zeiss | |
| ImageJ software | rsb.info. nih.gov/ij/download.html | free resource | |
| mouse anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T8203 | |
| rabbit anti-acH4K16 | Upstate Biotechnology | 07-329 | |
| AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG | Life Technologies | A21202 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma-Aldrich | D8417 | DAPI |
| centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| RNALater | Invitrogen | AM7020 | |
| Luciferase RNA | Promega | L4561 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| random hexamers | Thermofisher Scientific | N8080127 | |
| mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase | Thermofisher Scientific | 28025013 | |
| SYBR green supermix | BioRad | 1708880 | |
| specific primers | Sigma-Aldrich | specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource) | |
| thermal-cycler | BioRad | MyiQ | |
| mouse monoclonal anti-CENPA | Abcam | ab13939 | |
| mouse monoclonal anti-Aurora B | Abcam | ab3609 | |
References
- Dellenbach, P. Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval. Lancet. 1 (8392), 1467 (1984).
- Humaidan, P. Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting in clinical trials. Hum Reprod. , (2016).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs in Vivo and in Vitro : I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Emery, B. R., Wilcox, A. L., Aoki, V. W., Peterson, C. M., Carrell, D. T. In vitro oocyte maturation and subsequent delayed fertilization is associated with increased embryo aneuploidy. Fertil Steril. 84 (4), 1027-1029 (2005).
- Nichols, S. M., Gierbolini, L., Gonzalez-Martinez, J. A., Bavister, B. D. Effects of in vitro maturation and age on oocyte quality in the rhesus macaque Macaca mulatta. Fertil Steril. 93 (5), 1591-1600 (2010).
- Requena, A. The impact of in-vitro maturation of oocytes on aneuploidy rate. Reprod Biomed Online. 18 (6), 777-783 (2009).
- Franciosi, F. In vitro maturation affects chromosome segregation, spindle morphology and acetylation of lysine 16 on histone H4 in horse oocytes. Reprod Fertil Dev. , (2015).
- Franciosi, F. Changes in histone H4 acetylation during in vivo versus in vitro maturation of equine oocytes. Mol Hum Reprod. 18 (5), 243-252 (2012).
- Choi, Y. H., Gibbons, J. R., Canesin, H. S., Hinrichs, K. Effect of medium variations (zinc supplementation during oocyte maturation, perifertilization pH, and embryo culture protein source) on equine embryo development after intracytoplasmic sperm injection. Theriogenology. , (2016).
- Hendriks, W. K. Maternal age and in vitro culture affect mitochondrial number and function in equine oocytes and embryos. Reprod Fertil Dev. 27 (6), 957-968 (2015).
- Carnevale, E. M. The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman. Theriogenology. 69 (1), 23-30 (2008).
- Ginther, O. J. The mare: a 1000-pound guinea pig for study of the ovulatory follicular wave in women. Theriogenology. 77 (5), 818-828 (2012).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
- Duncan, F. E., Chiang, T., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that a defective spindle assembly checkpoint is not the primary cause of maternal age-associated aneuploidy in mouse eggs. Biol Reprod. 81 (4), 768-776 (2009).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (62), (2005).
- Choi, Y. H., Hochi, S., Braun, J., Sato, K., Oguri, N. In vitro maturation of equine oocytes collected by follicle aspiration and by the slicing of ovaries. Theriogenology. 40 (5), 959-966 (1993).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Akiyama, T., Nagata, M., Aoki, F. Inadequate histone deacetylation during oocyte meiosis causes aneuploidy and embryo death in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7339-7344 (2006).
- Homer, H. A. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes Dev. 19 (2), 202-207 (2005).
- Rambags, B. P. Numerical chromosomal abnormalities in equine embryos produced in vivo and in vitro. Mol Reprod Dev. 72 (1), 77-87 (2005).
- Nabti, I., Marangos, P., Bormann, J., Kudo, N. R., Carroll, J. Dual-mode regulation of the APC/C by CDK1 and MAPK controls meiosis I progression and fidelity. J Cell Biol. 204 (6), 891-900 (2014).
- Shomper, M., Lappa, C., FitzHarris, G. Kinetochore microtubule establishment is defective in oocytes from aged mice. Cell Cycle. 13 (7), 1171-1179 (2014).
- Luzzo, K. M. High fat diet induced developmental defects in the mouse: oocyte meiotic aneuploidy and fetal growth retardation/brain defects. PLoS One. 7 (11), e49217 (2012).
- Ma, P., Schultz, R. M. Histone deacetylase 2 (HDAC2) regulates chromosome segregation and kinetochore function via H4K16 deacetylation during oocyte maturation in mouse. PLoS Genet. 9 (3), e1003377 (2013).
- Yang, F., Baumann, C., Viveiros, M. M., De La Fuente, R. Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte. Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).
- Luciano, A. M. Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B. Biol Reprod. 88 (3), 58 (2013).
- Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development. Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).
- Terzaghi, L. PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis. Cell Cycle. , 1-14 (2016).
- Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. Translation in the mammalian oocyte in space and time. Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).
- Chen, J. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).
- Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse. Biol Reprod. 88 (1), 11 (2013).
