At Oositlerinde Kromozom Ayrımı, Histon Asetilasyonu ve İşmili Morfolojisi Analizi
Summary
Bu el yazması, at oositlerini morfolojik ve biyokimyasal olarak karakterize eden deneysel bir yaklaşımı anlatmaktadır. Özellikle mevcut çalışma, ultrason kılavuzluğundaki ovum toplama (OPU) ile olgunlaşmamış ve olgun ata oositlerinin nasıl toplanacağını ve kromozom ayrımını, iğ morfolojisini, küresel histone asetilasyonunu ve mRNA ekspresyonunu nasıl araştıracağını göstermektedir.
Abstract
Yardımlı üreme alanı kadınlar, eşlik eden hayvanlar ve nesli tükenmekte olan türlerde infertiliteyi tedavi etmek için geliştirilmiştir. Atta, yardımlı üreme, yüksek meslek sahiplerinden, spor kariyerine ara vermeden embriyoların üretilmesine olanak tanır ve yüksek genetik değerdeki kısraktan tüy sayısındaki artışa katkıda bulunur. Mevcut yazıda, yumurtalık toplama (OPU) kullanılarak at yumurtalıklarında olgunlaşmamış ve olgunlaşmış oositlerin toplanması için kullanılan prosedürler açıklanmaktadır. Bu oositler daha önce farelerde geliştirilen bir protokolü uyarlayarak anöploidite insidansını araştırmak için kullanıldı. Spesifik olarak, kromozomlar ve metafaz II (MII) oositlerinin santromerleri floresan olarak etiketlendi ve konfokal lazer mikroskop taramasından sonra ardışık odak planlarında sayıldı. Bu analiz, olgunlaşmamış oositler folliküllerden toplandığında ve in vitro olarak olgunlaştığında anöploidi oranının daha yüksek bir insidans olduğunu ortaya koymuşturIn vivo olarak. Tübülin için immün boyama ve spesifik lizin kalıntılarında dört aseton formatlı histon da mayotik iğnün morfolojisinde ve histon asetilasyonunun global modelinde farklılıklar ortaya çıkarmıştır. Son olarak, histon deasetilaz (HDAC) ve asetil transferazları (HAT) kodlayan mRNA'ların ifadesi, ters transkripsiyon ve kantitatif PCR (q-PCR) ile araştırıldı. Transkriptlerin nispi ekspresyonunda in vitro ve in vivo olgunlaşmış oositler arasında herhangi bir fark gözlemlenmedi. Oosit olgunlaşması sırasında transkripsiyonel aktivitenin genel bir susturulması ile uyumlu olarak, toplam transkript miktarının analizi sadece mRNA stabilitesini veya bozunumunu ortaya çıkarabilir. Bu nedenle, bu bulgular, diğer çeviri ve çevirim sonrası düzenlemelerin etkilenebileceğini göstermektedir.
Genel olarak, bu çalışmada morfolojik ve biyokimyasal olarak at oositinin karakterize edilmesine yönelik deneysel bir yaklaşım açıklanmaktadır.Düşük örnek kullanılabilirliği nedeniyle çalışmak son derece zorlu bir yazın. Bununla birlikte, monovulatör türlerde üreme biyolojisi ve infertilite hakkındaki bilgilerimizi genişletebilir.
Introduction
Kadınlar, eşlik eden hayvanlar ve nesli tükenmekte olan türlerde infertiliteyi tedavi etmek için çok sayıda yardımcı üreme tekniği geliştirilmiştir. Klinik ortamdaki en yaygın prosedürlerden biri, ultrason kılavuzluğunda transvaginal aspirasyon, ovum pick-up (OPU) 1 ile yumurtalık folliküllerinden metafaz II (MII) evre oositlerinin alınmasıdır. Bu oositler daha sonra in vitro döllenir (IVF) ve elde edilen embriyo bir alıcı rahime implante edilir. MII evresi (olgun) oositler, eksojen gonadotropinlerin uygulanmasından sonra alınır. Bununla birlikte, bu tedavi, bazı hastalarda, yumurtalık hiperstimülasyon sendromu (OHSS) 2 gelişimi ile ilişkilidir.
Tam olarak yetişmiş olgunlaşmamış oositlerin (GV evresi) folliküllerinden bir kez izole edilmiş mayonezleri kendiliğinden sürdürebilme yeteneğinden faydalanmak suretiyle, idare olmadan olgun oositlerin elde edilmesi mümkündürTering gonadotropin 3 . Bu prosedüre, oosit in vitro olgunlaşma (IVM) denir ve yardımcı üreme teknolojisi için daha az ilaç odaklı, daha ucuz ve daha hasta dostu bir yaklaşım temsil eder. Bununla birlikte, embriyo gelişiminin in vitro olarak değiştirilmiş oositlerle başarısı, genellikle in vivo olgunlaşmış oositlerde 4 , 5 olanlarla karşılaştırıldığında daha düşüktür. Olası bir açıklama , in vitro olgunlaşmış oositlerin kromozom ayrışımındaki hatalar tarafından daha fazla etkilenmesi ve oluşan anöploidinin normal embriyonik gelişimi bozmasıdır.
IVM sırasında kromozomal mis-segregasyonun moleküler temelini anlamak, sonuçta bu tekniğin tam potansiyelini açığa vuracaktır. Bu bağlamda , in vivo matur ile karşılaştırıldığında , in vitro olarak değişime uğramış oositlerin morfolojik ve biyokimyasal özelliklerini araştırmak için kullanılan deneysel yaklaşımEd oositler burada 7,8 tarif edilmiştir. Özellikle, olgunlaşmamış ve olgunlaşmış oositlerin OPU'su ve olgunlaşmamış oositlerin IVM'si için prosedürler, deneysel bir model olarak erişkin ve doğal döngü atları kullanılarak gösterilmektedir. Ardından, kromozom ayrımı, iğ morfolojisi ve bu gametlerde histon asetilasyonunun genel paternini incelemek için immünofloresans ve görüntü analizi kullanılır. Son olarak, ters transkripsiyon ve kantitatif PCR protokolü, mRNA ekspresyonunun analizi için tarif edilmiştir.
Kemirgen hayvan modelleriyle karşılaştırıldığında, atlar genetik manipülasyona izin vermez, manipüle edilmesi daha kolaydır ve pahalı bakım gerektirirler. Bununla birlikte, bu model insan yumurtalık fizyolojisine benzerliği nedeniyle oosit olgunlaştırma 9,10 çalışması için büyük ilgi kazanmaktadır 11,12 </ Sup>. Üstelik, yüksek genetik değere sahip kanatlılardan tüylü hayvan sayısının artmasına olanak tanıyacak şekilde, atın IVM-IVF güvenilir protokollerinin geliştirilmesi önemli bir ekonomik ilgiye sahiptir.
Oositlerde, özellikle de monovulatory türlerde deney yapmanın kısıtlamalardan biri, kısıtlı örneklerin bulunmasıdır. Bu limit, burada, daha önce farelerde geliştirilmiş bir yaklaşımı, örnek kaybını en aza indirgeyen kromozom sayımı yapmak için 13 , 14 atı oositlerine ayarlamakla (diğer mevcut tekniklerle karşılaştırma için tartışmaya bakarak) üstesinden gelinmiştir. Ayrıca, aynı numunede birden fazla analiz yapmak için üçlü flüoresans boyama protokolü optimize edilmiş ve sadece 2 oosit hücrelerinde q-PCR analizleri gerçekleştirilmiştir.
Genel olarak, bu çalışmada morfolojik ve biyokimyasal olarak amaçlanan deneysel bir yaklaşım açıklanmaktadır.Düşük örnek varlığı nedeniyle son derece zorlu bir hücre türü olan at oositini ractere edin. Bununla birlikte, monovulatör türlerin üreme biyolojisi ve infertilitesi hakkındaki bilgilerimizi genişletebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
IVM, atlarda 20 yıldan fazla bir süredir gerçekleştirilmiş olsa da 16 , oositin embriyonik anöploidinin kökeni olup olamayacağını henüz bilemiyoruz, çünkü insanlar için önerilmişti 17 . Bunun nedeni muhtemelen kromozom sayımı için oosit yayılımının hazırlanmasının önemli numune kaybına yol açmasıdır. Bu düşünceyle, at oositlerine en uygun tekniği bulmak için kromozom ayrımındaki hataları araştırmak için kullanılan yöntemlerin ar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Fabrice Vincent'a lazer tarama konfokal mikroskobu (LSCM) desteği ve Philippe Barrière ve Thierry Blard'a günlük ultrasonlu ovarian tarama ve hCG enjeksiyonu yapmaları için teşekkür etmek istiyorlar. Bu çalışma kısmen "Regione Sardegna ve Regione Lombardia" projesi "Ex Ovo Omnia" (Grub no 26096200, AML'ye) tarafından desteklendi; "2012 Olimpiyatları İçin L'Oreal Italia" bursu (Sözleşme 2012'den FF'ye), FP7-PEOPLE-2011-CIG, Araştırma İcra Ajansı (REA) "Pro-Ovum" (Hibe No: 303640'dan VL'ye); Ve Avrupa Sosyal Fonu, 2007-2013 İnsan Kaynaklarının Geliştirilmesi için Sektörel Operasyonel Programı (Sözleşme No. POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371'den IM'ye) tarafından birlikte finanse edilen Doktora Sonrası Tarım ve Veterinerlik Okulu tarafından hazırlanmıştır. In vivo oosit koleksiyonu Institut Français du Cheval et de l'Equitation tarafından finanse edildi.
Materials
| ultrasound probe | Aloka | UST-5820-7,5 | |
| human chorionic gonadotrophin | centravet | CHO004 | 1500unit/animal IV |
| detomidine | centravet | MED010 | 9-15µg/kg IV |
| butylscopolamine bromure | centravet | EST001 | 0,2mg/kg IV |
| stereomicroscope | NIKON | SMZ-2B | |
| butorphanol | centravet | DOL003 | 10µg/kg IV |
| benzyl-penicillin | centravet | DEP203 IM | 15000UI/animal |
| TCM199 | Sigma-Aldrich | M3769 10X1L | powder for hepes-buffered TCM199 |
| Hepes sodium salt | Sigma-Aldrich | H3784-100G | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| NaHCO3-buffered TCM199 | Sigma-Aldrich | M2154-500ML | liquid for IVM medium |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| newborn calf serum | Sigma-Aldrich | N4762-500ML | |
| 4-well dishes | NUNCLON | 144444 | |
| incubator | Heraeus | BB6060 | |
| monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
| triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232 | BioLegend | 636102 | |
| TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | 711-025-152 | |
| Vecta-Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YOPRO1 | Thermofisher Scientific | Y3603 | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 780 | Zeiss | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 700 | Zeiss | |
| ImageJ software | rsb.info. nih.gov/ij/download.html | free resource | |
| mouse anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T8203 | |
| rabbit anti-acH4K16 | Upstate Biotechnology | 07-329 | |
| AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG | Life Technologies | A21202 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma-Aldrich | D8417 | DAPI |
| centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| RNALater | Invitrogen | AM7020 | |
| Luciferase RNA | Promega | L4561 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| random hexamers | Thermofisher Scientific | N8080127 | |
| mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase | Thermofisher Scientific | 28025013 | |
| SYBR green supermix | BioRad | 1708880 | |
| specific primers | Sigma-Aldrich | specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource) | |
| thermal-cycler | BioRad | MyiQ | |
| mouse monoclonal anti-CENPA | Abcam | ab13939 | |
| mouse monoclonal anti-Aurora B | Abcam | ab3609 | |
References
- Dellenbach, P. Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval. Lancet. 1 (8392), 1467 (1984).
- Humaidan, P. Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting in clinical trials. Hum Reprod. , (2016).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs in Vivo and in Vitro : I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Emery, B. R., Wilcox, A. L., Aoki, V. W., Peterson, C. M., Carrell, D. T. In vitro oocyte maturation and subsequent delayed fertilization is associated with increased embryo aneuploidy. Fertil Steril. 84 (4), 1027-1029 (2005).
- Nichols, S. M., Gierbolini, L., Gonzalez-Martinez, J. A., Bavister, B. D. Effects of in vitro maturation and age on oocyte quality in the rhesus macaque Macaca mulatta. Fertil Steril. 93 (5), 1591-1600 (2010).
- Requena, A. The impact of in-vitro maturation of oocytes on aneuploidy rate. Reprod Biomed Online. 18 (6), 777-783 (2009).
- Franciosi, F. In vitro maturation affects chromosome segregation, spindle morphology and acetylation of lysine 16 on histone H4 in horse oocytes. Reprod Fertil Dev. , (2015).
- Franciosi, F. Changes in histone H4 acetylation during in vivo versus in vitro maturation of equine oocytes. Mol Hum Reprod. 18 (5), 243-252 (2012).
- Choi, Y. H., Gibbons, J. R., Canesin, H. S., Hinrichs, K. Effect of medium variations (zinc supplementation during oocyte maturation, perifertilization pH, and embryo culture protein source) on equine embryo development after intracytoplasmic sperm injection. Theriogenology. , (2016).
- Hendriks, W. K. Maternal age and in vitro culture affect mitochondrial number and function in equine oocytes and embryos. Reprod Fertil Dev. 27 (6), 957-968 (2015).
- Carnevale, E. M. The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman. Theriogenology. 69 (1), 23-30 (2008).
- Ginther, O. J. The mare: a 1000-pound guinea pig for study of the ovulatory follicular wave in women. Theriogenology. 77 (5), 818-828 (2012).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
- Duncan, F. E., Chiang, T., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that a defective spindle assembly checkpoint is not the primary cause of maternal age-associated aneuploidy in mouse eggs. Biol Reprod. 81 (4), 768-776 (2009).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (62), (2005).
- Choi, Y. H., Hochi, S., Braun, J., Sato, K., Oguri, N. In vitro maturation of equine oocytes collected by follicle aspiration and by the slicing of ovaries. Theriogenology. 40 (5), 959-966 (1993).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Akiyama, T., Nagata, M., Aoki, F. Inadequate histone deacetylation during oocyte meiosis causes aneuploidy and embryo death in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7339-7344 (2006).
- Homer, H. A. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes Dev. 19 (2), 202-207 (2005).
- Rambags, B. P. Numerical chromosomal abnormalities in equine embryos produced in vivo and in vitro. Mol Reprod Dev. 72 (1), 77-87 (2005).
- Nabti, I., Marangos, P., Bormann, J., Kudo, N. R., Carroll, J. Dual-mode regulation of the APC/C by CDK1 and MAPK controls meiosis I progression and fidelity. J Cell Biol. 204 (6), 891-900 (2014).
- Shomper, M., Lappa, C., FitzHarris, G. Kinetochore microtubule establishment is defective in oocytes from aged mice. Cell Cycle. 13 (7), 1171-1179 (2014).
- Luzzo, K. M. High fat diet induced developmental defects in the mouse: oocyte meiotic aneuploidy and fetal growth retardation/brain defects. PLoS One. 7 (11), e49217 (2012).
- Ma, P., Schultz, R. M. Histone deacetylase 2 (HDAC2) regulates chromosome segregation and kinetochore function via H4K16 deacetylation during oocyte maturation in mouse. PLoS Genet. 9 (3), e1003377 (2013).
- Yang, F., Baumann, C., Viveiros, M. M., De La Fuente, R. Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte. Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).
- Luciano, A. M. Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B. Biol Reprod. 88 (3), 58 (2013).
- Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development. Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).
- Terzaghi, L. PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis. Cell Cycle. , 1-14 (2016).
- Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. Translation in the mammalian oocyte in space and time. Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).
- Chen, J. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).
- Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse. Biol Reprod. 88 (1), 11 (2013).
