Mapeando as Interações RNA-ARN Globalmente Usando Psoraleno Biotinilado

Resumo

Aqui, detalhamos o método de equação de S de sorgo de P soralen reticulado, L igado e Híbridos H elegidos (SPLASH), que permite o mapeamento genômico de interações intramoleculares e intermoleculares RNA-RNA in vivo . SPLASH pode ser aplicado para estudar os interactomas de RNA de organismos, incluindo leveduras, bactérias e seres humanos.

Resumo

Saber como os RNAs interagem entre si e com os outros é fundamental para entender a regulação genética baseada no RNA na célula. Embora existam exemplos de interacções ARN-ARN, tais como interacções ARNm-ARNm, mostrou-se que regulam a expressão genética, a extensão total em que as interacções ARN ocorrem na célula é ainda desconhecida. Métodos anteriores para estudar as interações de RNA focaram principalmente em subconjuntos de RNAs que estão interagindo com uma determinada proteína ou espécies de RNA. Aqui, detalhamos um método chamado S equenciamento de P soralen reticulado, L igated, e S elegido H ybrids (SPLASH) que permite a captura do genoma de ARN interações in vivo de forma imparcial. SPLASH utiliza reticulação in vivo , ligação de proximidade e sequenciação de alto rendimento para identificar parceiros de ligação de bases de ARN intramoleculares e intermoleculares globalmente. SPLASH pode ser aplicado a diferentes organismos, incluindo bactérias, leveduras e células humanas, bemS diversas condições celulares para facilitar a compreensão da dinâmica da organização do RNA sob diversos contextos celulares. Todo o protocolo SPLASH experimental leva cerca de 5 dias para ser concluído eo fluxo de trabalho computacional leva aproximadamente 7 dias para ser concluído.

Introdução

Estudar como as macromoléculas se dobram e interagem entre si é a chave para a compreensão da regulação genética na célula. Embora muitos esforços tenham sido focados na década passada na compreensão de como o DNA e as proteínas contribuem para a regulação genética, relativamente menos se sabe sobre a regulação pós-transcricional da expressão gênica. O ARN contém informação tanto na sua sequência linear como na sua estrutura secundária e terciária ¹ . Sua capacidade de basear o par com si e com os outros é importante para a sua função in vivo . Os avanços recentes na sondagem de estrutura secundária de RNA de alto rendimento proporcio....

Protocolo

1. Tratamento de Células HeLa com Extracção de Psoraleno e ARN Biotinilados

1. Células HeLa de cultura em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina estreptomicina (PS) numa placa de 10 cm.
2. Lavar as células HeLa duas vezes com 5 mL de 1x PBS. Drene excesso de PBS completamente do prato, colocando o prato verticalmente por 1 min.
3. Adicionar 1 mL de PBS contendo 200 μM de psoraleno biotinilado e 0,01% p / v de digitonina, às células uniformemente e incubar a 37 ° C durante 5 min. Enquanto o psoraleno biotinilado pode entrar na célula, a sua permeabilidade é muito maior quando a....

Resultados

A Figura 1 ilustra o esquema do fluxo de trabalho SPLASH. Após a adição de psoraleno biotinilado na presença de 0,01% de digitonina e reticulação UV, o ARN total é extraído das células e é efectuada uma transferência de pontos para assegurar que a reticulação do biotinilado com o ARN tenha ocorrido eficientemente ( Figura 2 ). Utilizamos oligos biotinilados de 20 bases como controlos positivos para titular a quantidade de psoral.......

Discussão

Aqui, descrevemos em detalhes o fluxo de trabalho experimental e computacional para SPLASH, um método que nos permite identificar par-sábio RNA interações em um genoma-wide maneira. Utilizamos com sucesso SPLASH em bactérias, leveduras e culturas humanas e antecipamos que a estratégia pode ser amplamente aplicada a diversos organismos em diferentes estados celulares. Uma das etapas críticas no protocolo é começar com pelo menos 20 μg de RNA reticulado para ter material adequado para processos a jusante. O ARN é então fr.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 kb Plus DNA Ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10787026	DNA ladder
10 bp DNA ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10821-015	DNA ladder
20% SDS solution	Primeira BASE	BUF-2052-1L
20x SSC	First BASE	BUF-3050-20X1L
3.0 M Solução de Acetato de Sódio	First BASE	BUF-1151-1L-pH5.2	Necessário para precipitação de ácido nucleico
Solução de Acrilamida 40%, 19:1	Bio-Rad	1610145	TBE Componente de gel de ureia
Kit de tampão Ambion	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM9010
Persulfato de Amônio, Grau Molecular	Promega	V3131	TBE Componente do gel de ureia
RNA	clorofórmio	Merck	1,02445.1000
Sigma-Aldrich	B0126-25G		Bromofenol
CL9025K do	epicentro do Spin-X do diodo do ADN do ligador da fita do
	Sigma-Aldrich	CLS8160-96EA
cristalinos D5628-1G DIGITONIN CRISTALINO	Sigma-Aldrich	D5628-1G	Para tratamento celular
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	Dark Reader DR89X Transiluminador Transiluminador	luz azul
DNA Gel Loading Dye (6x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	R0611	Necessário para eletroporação de gel de agarose
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Pan BioTech	P04-03500	Para cultura de células Hela
Grânulos magnéticos de estreptavidina	Life Technologies Holdings Pte Ltd	65002	Dynabeads MyOne Streptavidin C1
Suporte magnético para 15  Tubos mL	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12301D	DynaMag-15
Suporte magnético para 15  Tubos mL Life	Technologies Holdings Pte Ltd	12321D	DynaMag-2
ThermoMixer	Eppendorf	5382 000.015	Eppendorf ThermoMixer  C
Psoraleno biotinilado	Life Technologies Holdings Pte Ltd	29986	EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotina
F8T5/BL	Hitachi	F8T5/BL	Lâmpada UV de 365 nm
Fetal Bovine Serum	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10270106	Componentes do meio Hela
Formamida	Promega	H5052	Componente no buffer de hibridização
G8T5	Sankyo-Denki	G8T5	Lâmpada UV de 254 nm
Glycogen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10814010	Necessário para precipitação de ácido nucleico
Nanodrop	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Nanodrop 2000	Espectrofotômetro para quantificação de ácido nucleico
Água livre de nuclease	Primeira BASE	BUF-1180-500ml
Estreptomicina Penicilina	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15140122	Componentes do meio Hela
Polimerase DNA de Alta Fidelidade (2x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	F531L	Master Mix de PCR de alta fidelidade Phusion com tampão HF (2x)
Conjunto de Primers 1	New England Biolabs	E7335L	Primers de PCR
Kit de extração de gel de DNA	QIAgen	28106	Kit de extração de gel QIAquick
Kit de quantificação fluorométrica	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Q32854	Qubit dsDNA HS Kit
de limpeza de RNA	Qiagen	74106	RNeasy Mini Kit Coluna de membrana de sílica
Inibidor de Rnase	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM2696	SUPERase In
Transcriptase reversa	Life Technologies Holdings Pte Ltd	18080400	SuperScript III Síntese de primeira vertente SuperMix
Gel de ácido nucleico Stain	Life Technologies Holdings Pte Ltd	S11494	SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polinucleotídeo Quinase	New England Biolabs	M0201L	Enzima de reparo final
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L	Enzima para ligação de proximidade
T4 RNA Ligase 2, truncado KQ	New England Biolabs	M0373L	Enzima para ligação do adaptador
Temed	Bio-Rad	1610801	TBE Componente de gel de ureia
Tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmio	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15596018	TRIzol® Reagente para extração de RNA
Ureia	Primeira BASE	BIO-2070-5kg
Reticulador UV	Stratagene	400072	UV Stratalinker 1800
Transiluminador UV	UVP	95-0417-01	Para visualização de bandas
Xileno Cyanol FF	Sigma-Aldrich	X4126-10G
Limpeza de DNA	Zymo Research	D4004	Zymo DNA concentrator-5
Lista de softwares necessários
software FastQC	0.11.4	http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
software SeqPrep	1.0.7	https://github.com/jstjohn/SeqPrep
software BWA	0.7.12	http://bio-bwa.sourceforge.net/
software SAMTOOLS	1.2.1	http://www.htslib.org/
PULLSEQ software	1.0.2	https://github.com/bcthomas/pullseq
software STAR	2.5.0c	https://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py script PYTHON	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py script PYTHON	2.7.11
pickJunctionReads.awk AWK script	AWK GNU 4.1.2	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Composição do tampão<
strong>Tampão de eluição
0,3 M acetato
< strong>Lysis Buffer
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Sempre adicione Superase-in fresco antes de usar, exceto ao lavar contas
Proteinase K Buffer
100 mM NaCl
10 mM Tris-Cl pH 7,0
1 mM EDTA
0,5% SDS
Tampão de hibridização
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamida (armazenar no escuro a 4 &graus; C)
Sempre adicione Superase-in fresco antes de usar
2x Tampão de lavagem SSC
2x NaCl e citrato de sódio (SSC) (diluído do estoque SSC Invitrogen 20x)
0,5% SDS
2x tampão de fragmentação de RNA
18 mM MgCl2
450 mM KCl
300 mM Tris-Cl pH 8,3
2x Carga de RNA Corante
95% Formamida
0,02% SDS
0,02% azul
0,01% de xileno cianol
1 mM EDTA
RT sequência de primer: AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG

Extração azul do do de do azul de Epicentro Filtros de https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src de sódio de bromofenol<td colspan="4">3' Sequência do adaptador de RNA: 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC