Abstract
Inspiriert durch den Erfolg der bisherigen Krebsnanomedizin in der Klinik haben die Forscher eine große Anzahl von neuen Formulierungen in den letzten zehn Jahren generiert. Jedoch nur eine geringe Anzahl von Nanomedizin wurden für die klinische Verwendung zugelassen, während die Mehrzahl der Nanomedizin in der klinischen Entwicklung enttäuschenden Ergebnissen geführt haben. Ein wesentliches Hindernis für die erfolgreiche klinische Übersetzung des neuen Krebsnanomedizin ist der Mangel an einem genauen Verständnis ihrer in vivo Leistung. Dieser Artikel enthält ein rigoroses Verfahren das in vivo Verhalten der Nanomedizin in tumortragenden Mäusen bei einer systemischen, Gewebe, single-cell und subzellulären Ebenen über die Integration der Positronen - Emissions - Tomographie-Computertomographie (PET-CT), Radioaktivität Quantifizierungsverfahren zur Charakterisierung fließen, Zytometrie und Fluoreszenzmikroskopie. Mit diesem Ansatz können die Forscher auswerten genau neuartigen nanoskaligen Formulierungen in relevanten Mausmodellen der cancer. Diese Protokolle können die Fähigkeit haben, die vielversprechendsten Krebs Nanomedizin mit hohem translationalen Potenzial zu identifizieren oder bei der Optimierung von Krebs Nanomedizin für die zukünftige Übersetzung zu helfen.
Introduction
Nano verschiebt sich das Paradigma der Krebsbehandlung Entwicklung 1. Inspiriert durch die enorme klinische Auswirkungen früherer Krebs Nanomedizin, wie liposome- und Albumin-basierte nanotherapies 2, 3, haben viele neue Formulierungen wurden in den letzten zehn Jahren hergestellt. Jüngsten Analysen der klinischen Übersetzungs Erfolg dieser Krebsnanomedizin zeigen jedoch, dass nur einige von ihnen sind für die klinische Anwendung 4, 5 zugelassen. Ein großes Hindernis für die klinische Umsetzung von neuen Krebsnanomedizin ist ihre begrenzte Verbesserung des therapeutischen Index im Vergleich mit der direkten Verwaltung der freien therapeutischen Verbindungen 6. Als solche genaue Auswertung der in vivo - Leistung Nanomedizin bei systemischer, Gewebe und zellulärer Ebene in vorklinischen Tiermodellen ist wesentlich für identifdiejenigen y mit optimalen therapeutischen Indizes für zukünftige klinische Übersetzung.
Nanomaterialien können in lebenden Tieren , die mit der Positronen - Emissions - Tomographie (PET) Bildgebung für die quantitative Charakterisierung radioaktiv markiert werden, die 7 hervorragende Sensitivität und Reproduzierbarkeit bei allen klinischen Bildgebungsverfahren hat. Zum Beispiel 89 Zr-markierte lange Zirkulationsnanomedizin haben in Mausmodellen für Krebs 8, 9, 10, wie auch in anderen Krankheitsmodellen 11 charakterisiert. Darüber hinaus kann der Bluthalbwertszeit und biologische Verteilung der Nanomedizin extensiv durch Verwendung ex vivo Messungen der Radioaktivität in einzelnen Geweben 8 ausgewertet werden. Daher ermöglicht die radioaktive Markierung für die quantitative Bewertung von Nanomedizin bei einer systemischen und Gewebespiegel.
Wichtig ist, dass radiolabeled Nanomedizin allgemein kann nicht auf Einzelzell oder subzellulären Ebenen aufgrund der begrenzten räumlichen Auflösung des radioaktiven Signals analysiert werden. Daher Fluoreszenzmarkierung erweist sich für die Beurteilung von Nanopartikeln mit optischen Abbildungstechniken wie Durchflußzytometrie und Fluoreszenzmikroskopie 12 eine komplementäre Modalität sein. Zu diesem Zweck markiert Nanopartikel mit Radioisotopen und Fluoreszenzmarkierungen kann quantitativ in vivo durch nukleare Bildgebung ausgewertet werden und ex vivo durch Radioaktivität Zählen, und sie können auch ausgiebig auf zellulärer Ebene durch die optische Abbildungs charakterisiert werden.
Zuvor haben wir modular Verfahren entwickelt radioaktive und fluoreszierende Markierungen in verschiedene Nanopartikel einzuarbeiten, einschließlich High-Density - Lipoprotein (HDL) 11, Liposome 9, 10, polymere Nanopartikel, Antikörperfragmente und nanoemulsions 10, 13. Diese markierten Nanopartikel wurden zur quantitativen Charakterisierung in relevanten Tiermodellen auf verschiedenen Ebenen erlaubt, die die Optimierung dieser Nanomaterialien für ihre spezifischen Anwendungen geführt. In der aktuellen Studie ist es das Ziel 14 liposomalen Nanopartikel-die meisten etablierten Nano Plattform -wie ein Beispiel zu verwenden , umfassende Verfahren zu demonstrieren , einen Dual-markierte Nanopartikel zu erzeugen , und um es gründlich zu charakterisieren in einem klassischen syngenen Melanom B16-F10 - Maus - Modell 15 . Aus den Ergebnissen können wir diese Nanopartikel Charakterisierung Ansatz überzeugt, angepasst werden kann andere Krebsnanomedizin in relevanten Mausmodellen zu bewerten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Das Verfahren besteht aus dem Dual - radioaktive und fluoreszierende Markierung von Nanopartikeln in vivo PET-CT - Bildgebung, ex vivo Bioverteilung Messungen und ex vivo - Immunfärbung und Durchflusszytometrie analysiert. Alle Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee von Memorial Sloan Kettering Cancer Center genehmigt.
1. Herstellung von zweifach markierten Liposome
HINWEIS: Syngene B16 Melanomtumoren kann durch Einspritzen von 300.000 B16-F10-Zellen in den hinteren Flanken von C57BL / 6-Mäusen unter Narkose durch das Einatmen von 2% -Isofluran haltigen Sauerstoff induziert werden. Verwenden Sie sterile Reagenzien und Werkzeuge in einem sterilen Arbeitsbereich während der Operation. Nach der Operation sorgfältig beobachten die Tiere bis zu ihrem Erwachen aus der Narkose. Setzen Sie die Tiere wieder in ihren Käfigen nur dann, wenn sie die volle Bewusstsein und Mobilität wiederzuerlangen. Haus sie in sterilen Räumen für Tiere mit xenografted Tumoren. Tumoren mit einer Größevon 300 mm sind 3 für Nanopartikel - Charakterisierung ideal aufgrund ihrer ausgeprägten erhöhte Permeabilität und Retention Effekte (EPR), die Nanopartikel - Akkumulation zu erhöhen. Die detaillierten Protokolle sind unten angegeben.
- In einem Rundkolben wurde ein Gemisch aus 20 mg der Lipide in 2 ml Chloroform , enthaltend 1,2-Dipalmitoyl- sn - glycero-3-phophocholine (DPPC) auflösen, Cholesterol, 1,2-sn - glycero disearoyl- 3-phosphoethanolamin-poly (ethylenglykol) 2000 (DSPE-PEG2000), DSPE-Deferoxamin (DFO-DSPE) 8, und 1,1-diododecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine-5,5-disulfonsäure ( DiIC12 [5] -DS) bei molaren Verhältnissen von 61,3%, 33,4%, 5, 0,2% und 0,1% betragen.
ANMERKUNG: Diese Lipidzusammensetzung ist sehr ähnlich zu der liposomalen Formulierung von Doxorubicin verwendet wird derzeit in der Klinik 2. Die resultierenden Liposomen aus unserem Verfahren wird eng imitieren die in vivo - Wirksamkeit der klinischen nanomedicine. - Verwenden eines Rotationsverdampfers das organische Lösungsmittel zu entfernen und eine dünne Lipidfilm bei Raumtemperatur bilden. 20 ml PBS und beschallen für 30 min zur liposomalen Nanoteilchen erzeugen, indem ein 3,8-mm Beschallungsspitze und einer Amplitude von 30 W verwendet, wobei eine ausreichende Kühlung auf Eis.
- Zentrifugieren Sie die Liposom-Lösung bei 4.000 × g für 10 min die Aggregate zu entfernen und zu waschen, die Nanopartikel mit PBS unter Verwendung von Zentrifugenfiltration (Molekulargewicht cut-off (MWCO:. 100 kDa) freie Lipide und restliche organische Lösungsmittel zu entfernen, konzentrieren sich die Liposomen, die wird bleiben in der oberen Kammer, und übertragen sie in ein neues Röhrchen. die Liposome können, bevor die nachfolgenden Schritte für bis zu 1 Woche in PBS in einem Kühlschrank gelagert werden.
- Für die Qualitätskontrolle, charakterisieren die Liposomen durch dynamische Lichtstreuung (DLS). Genauer gesagt, mit 950 & mgr; l PBS, 50 & mgr; l Liposomen mischen und dann die Mischung in die Schlichte Küvette übertragen. Setzen Sie die Küvette in den Analysator und messen den PartikelGrößen und deren Größenverteilung. Die Teilchengrößen und deren Größenverteilung (Polydispersitätsindex (PDI)) erwartet 90 zu sein - jeweils 0,2, - 120 nm und 0,1.
- Zur radioaktiven Markierung, mischen die gereinigten Liposomen, entsprechend 2 mg von Lipiden, in PBS bei einem pH - Wert zwischen 6,9 und 7,1 mit 1 mCi 89 Zr-Oxalat bei 37 ° C für 2 h in einem 1,5-ml - Röhrchen, (Gesamtvolumen: ~ 100 & mgr; l). Entfernen Sie die freie, nicht umgesetzten 89 Zr durch Zentrifugenfiltration (MWCO = 100 kDa), ähnlich zu Schritt 1.3 umgesetzt. Waschen des Retentats mit sterilem PBS und verdünne sie auf das gewünschte Volumen. 95% - Die radiochemische Ausbeute sollte 80 sein.
VORSICHT! Arbeiten mit radioaktiven Stoffen ist stark reguliert. Die Institute müssen die notwendigen Einrichtungen, Personal Training zertifiziert und bieten werden, und eine strenge Überwachung der Radioaktivität Einsatz. Forscher müssen eine angemessene Ausbildung zu erhalten und persönliche Schutzausrüstung und Dosimetrie Ringe / Abzeichen tragen, wenn die Radioaktivität der Handhabung. - Nach radioaktiven Markierung, um die Größe der Nanopartikel durch dynamische Lichtstreuung bestimmen. Die Größe und die PDI werden voraussichtlich innerhalb der gleichen Größenordnung wie die Messungen in Schritt 1.4 10 zu sein.
HINWEIS: Wenn radioaktive Proben nicht im Flow Cytometer erlaubt oder Fluoreszenzmikroskop, nicht-radioaktive nat Zr-Oxalat verwendet werden können Liposomen in Schritt 1.5 zu etikettieren. Diese nicht-radioaktiven Liposome haben identische Eigenschaften ihrer radioaktiven Analoga. Eine Beschreibung dieses Verfahrens ist in Figur 2 zur Verfügung gestellt.
2. In - vivo - PET-CT Bildgebung und Biodistribution Dual-markierten Liposome
- Injizieren etwa 100 & mgr; l doppelt markierte Liposomen with etwa 300 & mgr; Ci von Radioaktivität in gezügelt Melanom - Mäuse (C57BL / 6, weiblich, 10 - 16 Wochen alt) durch ihre Schwanzvenen, bei etwa 10 mCi 89 Zr / kg Körpergewicht.
- Um die Halbwertszeit bestimmen, ziehen Blut aus der Schwanzvene von narkotisierten Tieren unter 2% Isofluran-Sauerstoff enthält, unter Verwendung von 28-G Insulinspritzen. Sammeln Blut (10 bis 20 & mgr; l) in vorgewogenen Röhrchen bei 2 min, 15 min, 1 h, 4 h, 8 h, 24 h und 48 h nach der Injektion. Wiegen Sie das Blut durch den Unterschied bestimmen Radioaktivität Inhalt eines Gammazählers verwendet, und berechnen die Radioaktivität Konzentration als Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm (% ID / g).
HINWEIS: Führen Sie das Verfahren in einem Raum mit einem Anästhesiesystem ausgestattet, Erholungskäfigen, eine Heizung und ein Biohazard Kapuze. Stellen Sie sicher, dass die Tiere vollständig zu erholen und normale Beweglichkeit nach dem Verfahren gewinnen, bevor sie von Erholungskäfigen zu halten Käfige zu übertragen. Haus der tumortragenden Tiere in Räumen für Tiere bezeichnet, verabreicht mitradioaktive Materialien. - 24 oder 48 h nach der Injektion des Liposomen, Bild die Mäuse in einem Kleintier - microPET-CT - Scanner 10. Platzieren Sie den narkotisierten Tier horizontal auf dem Bauch und halten Sie sie narkotisiert. Verwalten 2% Isofluran-Sauerstoff durch einen Nasenkegel. Bewerben Augensalbe auf seine Augen vor dem Scan zu verhindern, dass sie vor dem Austrocknen.
- Führen Sie eine Ganzkörper-PET statischen Scan-Aufnahme mindestens 50 Millionen übereinstimmend Ereignisse, mit einer Dauer von etwa 15 min. Stellen Sie die Energie und Koinzidenzzeitfenster bei 350-700 keV und 6 ns sind. Danach führen Sie eine 5-min-Computertomographie (CT). Stellen Sie die Röntgenröhre mit einer Spannung von 80 kV und einem Strom von 500 uA; die CT - Abtastung verwendet 120 Rotationsschritte für insgesamt 220 Grad, mit ca. 145 ms pro Rahmen 10.
- Nach dem PET-CT-Scan, opfern sofort die Mäuse durch Ersticken mit Kohlendioxid und bestätigen den Tod von pinching die Pfoten der Tiere. Sobald zervikalen Versetzungen bestätigt, führen.
- Entfernen Sie die Blut in Geweben der Maus durch das erste offene rechte Atrium Schneiden und dann Einspritzen von 20 ml PBS in den linken Ventrikel und anschließend die relevanten Geweben sammeln wie Tumor, Leber, Milz, Lunge, Niere, Muskel und andere 16.
- Wiegen Sie das Gewebe messen ihre Radioaktivität Gehalt durch Gammazählung 8, 9, und berechnen die Radioaktivität Gewebeakkumulation als Prozentsatz der injizierten Dosis pro g (% ID / g).
3. Ex - vivo - Durchflusszytometrie und Immunostaining
HINWEIS: Injizieren etwa 100 & mgr; l von fluoreszierenden Liposomen in Melanom-Mäuse durch ihre Schwanzvene in einer Dosis von 0,5 mg Farbstoff pro kg Körpergewicht. Wenn radioaktive Proben werden in dem Durchflusszytometer und Fluoreszenzmikroskop nicht erlaubt, nicht radioaktiven Liposome verwendet werden.
- Opfern, um die Mäuse 24 Stunden nach der Injektion, wie in Schritt 2.5, und sammeln die Tumoren, die in kaltem PBS gelagert werden müssen.
- Für die Durchflusszytometrie folgendermaßen vor 17:
- Vorbereiten eines Enzymcocktail aus einer Mischung von gereinigtem Kollagenase I besteht, und II (4 U / ml), Hyaluronidase (60 U / ml) und DNase I (60 U / ml) in Durchflusszytometrie-Puffer (PBS mit 0,5% BSA und 1 mM EDTA).
- Mischungs 100 mg von Tumorgewebe mit 200 & mgr; l Enzymcocktail-Puffer in einem 1,5-ml-Röhrchen und würfeln das Gewebe in kleine Stücke mit einer feinen Schere. Einen weiteren hinzufügen 1,3 ml Enzymcocktail in das Rohr und übertragen seinen Inhalt auf eine 6-Well-Platte.
- Schütteln Sie die 6-Well-Platte auf einem horizontalen Schüttler in einem C-Ofen 37 ° gelegt für 60 min bei 60 Umdrehungen pro Minute.
- Waschen Sie das Gewebehomogenat mit Durchflusszytometrie-Puffer 3 mal eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
- Beflecken die Zellen mit einem Cocktail von Antikörpern, die spezifisch an Biomarkern einschließlich CD45, CD11b, Ly6C, CD11c,CD64, CD3, MHCII und CD31 (1: 200-Verdünnung für alle Antikörper, Klon Informationen werden im Materialkalkulationstabelle zur Verfügung gestellt). Identifizierung relevanten Zelltypen und bestimmen deren mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von DiIC12 (5) -DS in jeder Zellpopulation mit einem entsprechenden Durchflusscytometrie-Analyse-Software.
- Für die Immunfärbung, gehen Sie folgendermaßen vor:
- Legen Sie einen Tumor in eine Kassette mit einer optimalen Schneidmedium (OCT) gefüllt und frieren sie auf Trockeneis.
- Machen Sie 6 um gefrorene Schnitte von Tumorgewebe und legen sie auf die Histologie Glasobjektträger; die Abschnitte sollten die größten Querschnitte des Tumors Abdeckung, die den repräsentativsten Informationen auf dem Gewebe bereitzustellen.
- Stain die Biomarker (zB CD31 für Endothelzellen) von Interesse mit den entsprechenden Antikörpern (zB anti-CD31, Klon MEC13.3). Befestigen Sie die Abschnitte mit Paraformaldehyd; blockieren sie mit Serum der Spezies Ursprung der Sekundärantikörper übereinstimmt; incubaß mit primären Antikörpern für 12 h bei 4 ° C und anschließend mit Sekundärantikörper für 2 h; und schließlich waschen mit PBS und Deckel mit Deckel rutscht. Bild die gefärbten Objektträger mit einem Leica aufrechten konfokalen Mikroskop SP5 13, 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1 zeigt einen Überblick über das Verfahren. Figur 2 zeigt den schematischen Syntheseverfahren der dual-markierte Liposomen in Schritt 1 beschrieben 10. Abbildung 3 zeigt eine repräsentative PET-CT - Bild (Abbildung 3a), Radioaktivität Quantifizierung von PET - Bildgebung (Abbildung 3b), Bluthalbwertszeit (Abbildung 3c) und biologische Verteilung (Abbildung 3d) von radioaktiven Nanopartikel, wie in Schritt 2 beschrieben in Figur 3a, die Liposomen ansammeln hoch in den Tumor, der durch die Quantifizierung der Abbildungsergebnisse in Figur 3b bestätigt wird. Weiterhin zeigen Liposomen eine Bluthalbwertszeit von etwa 10 h in Figur 3c. Die ex vivo Bioverteilung bestätigt die hohe Tumor Akkumulation von Liposomen. Schließlich 4 stellt eine typische Gating - procedure zu relevanten Zellen in einem Tumor für die Einzelzellebene Analyse der Nanopartikel - Akkumulation (Abbildung 4a und b) zu identifizieren, die die bevorzugte Akkumulation der Nanopartikel in Tumor-assoziierten zeigt Makrophagen (TAM). Eine repräsentative konfokalen Mikroskopiebild zeigt auch die Überlappung zwischen Nanopartikeln und Endothelzellen (Figur 4c).
1. Schematische Übersicht über die In - vivo - Nanocharakterisierungsverfahren Abbildung. Dieses Verfahren umfasst die Kennzeichnung von Nanopartikeln mit sowohl radioaktive und fluoreszierende Markierungen; die Charakterisierung von radiomarkiertem Nanopartikel mit PET-CT-Bildgebung, Bluthalbwertszeit-Messungen und biologische Verteilung Bewertungen; und die Einzelzellen-und subzellulären Analyse von fluoreszierenden Nanopartikeln mittels Durchflusszytometrie und immunostaining, respectively. Die Techniken, von links nach rechts, bieten räumliche Auflösung von Nanopartikel in vivo Akkumulation zu erhöhen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Syntheseverfahren Dual-markierten Liposome. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
3. Repräsentative Ergebnisse von In - vivo - Charakterisierung von radiomarkiertem Nanopartikel Abbildung. (a) PET-CT - Bilder eines tumor-tragenden Maus nach der Nanopartikel Injektion und (b) PET-derived Aufnahmewerte in mehreren Geweben (n = 3). (c) Blutradioaktivität Halbwertszeit eines radiomarkierten Nanoteilchen, sowie (d) seine Bioverteilung bei 24 h nach der Injektion (n = 3). Die Fehlerbalken sind die Standardabweichung. Geändert von Referenz 8, mit freundlicher Genehmigung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
4. Repräsentative Ergebnisse der in vivo Charakterisierung von fluoreszierenden Nanopartikeln Abbildung. (a) Ein typisches Durchflusszytometrie Gating Verfahren tumorassoziierten Immunzellen, Tumorzellen und Endothelzellen (EC), sowie (b) die Quantifizierung der nanoparti zu identifizierenCLE Akkumulation in diesen Zellen 8. Ein repräsentatives Bild von 3 biologischen Wiederholungen. (c) Repräsentative Immunofluoreszenz Bild der spezifischen Ausrichtung eines RGD-konjugierten Nanoemulsion 13 zeigt Zellen in Tumoren an Endothelzellen. Geändert von Referenzen 8 und 13, mit freundlicher Genehmigung. Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische Schritte im Protokoll:
Die hohe Qualität der dual-markierte Liposomen ist der Schlüssel konsistente Ergebnisse über einen langen Zeitraum zu erzeugen. Freie Fluoreszenzfarbstoffe oder 89 Zr - Ionen können völlig unterschiedliche Targeting - Muster erzeugen und müssen vollständig während der Reinigungsschritt entfernt werden. Darüber hinaus deutlich, wenn das Immunsystem experimentellen Krebsnano Leistung beeinflusst, sollte die Verwendung von immunkompetenten Mausmodelle bevorzugt sein, wie die B16-F10-Melanom-Modell in C57BL / 6-Mäuse, die in diesem Protokoll verwendet wurde. Wenn der Tumor-Mikroumgebung oder eine bestimmte Kombination von genetischen Mutationen, ein wichtiger Faktor ist, Patienten stamm Modelle Tumorxenotransplantates würde ideal Wahl.
Umbau und Fehlerbehebung:
Unser Verfahren eine einfache und zuverlässige Art und Weise stellt die in - vivo - Leistung von Nanomedizin in tumortragenden eine zu bewertenimals. Dieses Verfahren dient als Rückgrat spezifische Experimente zu bauen Krebsnanomedizin für verschiedene Anwendungen zu charakterisieren. Zum Beispiel können die Forscher quantitative in vivo pharmakokinetischen Eigenschaften des Nanomaterials bestimmen , wenn PET-CT - Scans zu mehreren Zeitpunkten an den gleichen Tieren 17 durchgeführt werden; sie können durch die Analyse anderer Gewebe, wie beispielsweise den Dickdarm, Dünndarm, Pankreas, Gehirn, Haut, Thymus, Magen oder Speicheldrüsen Bioverteilung Informationen der Nanomaterialien zu sammeln, wie es in anderen Veröffentlichungen 18 gezeigt, 19, 20, 21; oder sie können durch die Anwendung dieser Durchflusszytometrie und Immunofärbungsprotokoll die Einzelzelle und subzellulärer Spezifität von Nanomedizin in relevanten anderen Geweben als Tumoren zu bewerten.
Einschränkungen der Technik:
Dieses Protokoll requires einige spezialisierte Forschungsinfrastruktur einschließlich Radiochemie und Imaging-Einrichtungen-und technisches Know-how in die radioaktive Markierung, Kleintier-Bildgebung und Immunologie. Daher wäre es im Idealfall von einem multidisziplinären Team von Forschern mit Know-how in den relevanten Bereichen durchgeführt werden. Unsere eigene Erfahrung zeigt, dass die optimale Durchführung dieses Verfahrens eine sorgfältige Planung und eine effiziente Zusammenarbeit erfordert.
Es ist erwähnenswert, dass die spezifischen Protokolle und vorgeschlagenen Mitteln in diesem Manuskript am besten für die radioaktive Markierung von lipidbasierten Nanopartikeln geeignet sind. Jedoch kann das Konzept der dual-markierte Nanopartikel eingesetzt werden, um andere Nanopartikel Formulierungen zu charakterisieren, die sich zum Beispiel auf Basis von Gold-Nanokristalle, Polymere, oder auch Viruspartikel. In diesen Fällen werden verschiedene Markierungsstrategien erforderlich. Es ist wichtig , die Vielzahl von radioaktiven Isotopen in der biomedizinischen Bildgebung verwendet hervorzuheben, einschließlich 89 Zr, 18 64 Cu, 68 Ga und 123 I, um nur ein paar 7. Die Wahl des Radioisotops muss basierend auf den spezifischen Eigenschaften des Nanomaterials unter Untersuchung gemacht werden, vor allem seine Blutzirkulation Halbwertszeit für die vollständige Charakterisierung zu späteren Zeitpunkten zu ermöglichen. Aber auch andere Faktoren, wie Markierungschemie oder Isotop Verfügbarkeit, kann die endgültige Auswahl beeinflussen. Für diese Studie wurde 89 Zr gewählt , weil seine langen Halbwertszeit (t 1/2 = 78,4 h) ist vergleichbar mit dem Bluthalbwertszeit von Liposomen. Bemerkenswerterweise kann dieses Protokoll auch mit anderen Isotopen, wie 99m Tc, 111 In oder 125 I, das sind im Handel erhältlich und eignen sich für Bildgebung mit Einzelphotonenemission - Computertomographie (SPECT) durchgeführt werden. Ebenso DILC wurde aufgrund seiner hohen Hydrophobizität gewählt und damit eine hohe Beladungseffizienz in Liposomen. Andere fluoreszierende Farbstoffe mit ungünstigen physikochemischen properties kann direkt an die Phospholipide 17 konjugiert werden.
Bedeutung der Techniken:
Dieses Verfahren stellt hohe translationale Potenzial, wenn Nanomedizin in klinischen Studien zur Bewertung angepasst. Die 4 wichtigsten Techniken, nämlich PET-CT-Bildgebung, Radioaktivitätsmessung, Durchflusszytometrie und Immunhistochemie-für onkologische Diagnose bei Patienten routinemäßig eingesetzt. Daher kann dieses Verfahren leicht die präklinische in - vivo - Leistung der Nanomedizin in der klinischen Phase auszuwerten übersetzt werden. Weiterhin ermöglicht die größere Größe von menschlichen Organen im Vergleich zu Mäusen , für eine genauere Analyse von PET-CT - Bildgebung 22, die die invasive Biopsie-basierte Messung von Radioaktivität Nanoakkumulations ersetzen kann. In dieser Einstellung nicht-invasive, bildgesteuerte Protokolle können Patienten zu stratifizieren entwickelt und Patienten Ergebnis 10 homogenisieren zu helfen. Deveradioaktive Nanomaterialien loping erfordert immer noch eine erhebliche Investitionen in die Infrastruktur. Alternativ können nicht-radioaktiven Bildgebungsverfahren basierend auf der Magnetresonanztomographie (MRI) haben sich schnell wurden in den letzten zehn Jahren entwickelt. Zum Beispiel verwendet Magnetic Particle Imaging (MPI) kleine Eisenoxid - Nanoteilchen (10 bis 20 nm) und kann viel mehr quantitative Bewertung der Nanomedizin , markiert mit Eisenoxid - Nanopartikel in vivo als die derzeitigen MRI - Techniken 23 bereitzustellen. Klinische Übersetzung von MPI würde mehr den Forschern ermöglichen , in - vivo - Bildgebungsverfahren robust zu verwenden , um die in vivo - Wirksamkeit von Krebsnanomedizin zu bewerten.
Zukünftige Anwendungen:
Sobald Forscher diese Protokolle beherrschen, können sie die Verfahren in den meisten fluoreszierenden und radioaktiven dual-markierte, neue Materialien zu charakterisieren, einschließlich Peptiden, Proteinen, Antikörpern, Antikörperfragmenten, und so weiter. Diese VerfahrenWissenschaftler können helfen , die in vivo - Wirksamkeit von neuartigen biomedizinischen Materialien gründlich zu bewerten und solche mit großen translationale Potenzial zu identifizieren.
Abschließend wollen wir eine umfassende Charakterisierung der Nanomedizin Verfahren einzuführen, die systemische zur Verfügung stellen kann, Gewebe, Single-Cell und subzellulärer Ebene den Bereich Nanomedizin Anhäufung Informationen. Derzeit scheitern die meisten Krebsnanomedizin noch in der Phase I der klinischen Studien aufgrund ihrer suboptimal Pharmakokinetik, Bioverteilungen und Toxizitätsprofile. Auf der anderen Seite, beauftragt die große Heterogenität der Therapie als Reaktion auf den Bereich Nanomedizin ein Begleiter Imaging-Strategie für die Auswahl der Patienten, die vor allem aus diesen experimentellen Nanomedizin profitieren können. Wir glauben, dass die Annahme dieses Verfahren, um die Gemeinschaft helfen könnte, viel versprechende Nanomedizin mit hohem translationalen Potenzial in präklinischen Tiermodellen und mit der richtigen Modifikation zu identifizieren, könnte auch klinische helfenForscher Patienten zugänglich nanotherapy zu identifizieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPPC | Avantilipids | 850355 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DSPE-PEG2000 | Avantilipids | 880120P | |
| DSPE-DFO | Home made | 110634 | Perez-Medina et al., JNM, 2014 |
| DiIC12[5]-DS | AAT Bioquest | 22051 | |
| Centrifugal filter | Vivaproducts | VS2061 | |
| Rotary evaporator | Buchi | R-100 | |
| Radio-HPLC | Shimadzu HPLC with 2 LC-10AT pumps | N/A | |
| 89Zr-oxalate | MSKCC | Synthesized in house | TR19/9 variable beam cyclotron (Ebco Industries Inc.) |
| Micro PET-CT | Siemens | Inveon Micro-PET/CT | |
| Gamma counter | PerkinElmer | 2470-0150 | |
| Flow cytometry | BD Biosciences | Fortessa | Any multi-parametric flow cytometry analyzers would suffice |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | ||
| B16-YFP melanoma cells | Home made | N/A | Salmon et al., Immunity, 2016 |
| Ly6C (clone HK1.4)--APC-Cy7 | 128025 | Biolegend | |
| MHCII (M5/114/152)--APC | 107613 | Biolegend | |
| CD45 (30-F11)--BV510 | 103137 | Biolegend | |
| CD64 (X54-5/7.1)--PE-Cy7 | 139313 | Biolegend | |
| CD11b (M1/70)--BV605 | 101237 | Biolegend | |
| CD3 (17A2)--BV711 | 100241 | Biolegend | |
| CD31 (13.3)--PE | 561073 | Biolegend | |
| CD11c (M418)--PerCP-Cy5.5 | 117327 | BD Biosciences | |
| CD31 (13.3) no fluorophore | 550274 | BD Biosciences |
References
- Peer, D., et al. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nat Nanotechnol. 2, 751-760 (2007).
- Barenholz, Y. Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. J Control Release. 160, 117-134 (2012).
- Green, M. R., et al. Abraxane, a novel Cremophor-free, albumin-bound particle form of paclitaxel for the treatment of advanced non-small-cell lung cancer. Ann Oncol. 17, 1263-1268 (2006).
- Juliano, R.
- Ledford, H. Bankruptcy filing worries developers of nanoparticle cancer drugs. Nature. 533, 304-305 (2016).
- Venditto, V. J., Szoka, F. C. Jr Cancer nanomedicines: so many papers and so few drugs! Adv Drug Deliv Rev. 65, 80-88 (2013).
- Dunphy, M. P., Lewis, J. S. Radiopharmaceuticals in preclinical and clinical development for monitoring of therapy with PET. J Nucl Med. (50 Suppl 1), (2009).
- Perez-Medina, C., et al. PET Imaging of Tumor-Associated Macrophages with 89Zr-Labeled High-Density Lipoprotein Nanoparticles. J Nucl Med. 56, 1272-1277 (2015).
- Perez-Medina, C., et al. A modular labeling strategy for in vivo PET and near-infrared fluorescence imaging of nanoparticle tumor targeting. J Nucl Med. 55, 1706-1711 (2014).
- Perez-Medina, C., et al. Nanoreporter PET predicts the efficacy of anti-cancer therapy. Nature communications. , (2016).
- Tang, J., et al. Inhibiting macrophage proliferation suppresses atherosclerotic plaque inflammation. Science advances. , (2015).
- Priem, B., Tian, C., Tang, J., Zhao, Y., Mulder, W. J. Fluorescent nanoparticles for the accurate detection of drug delivery. Expert Opin Drug Deliv. 12, 1881-1894 (2015).
- Gianella, A., et al. Multifunctional nanoemulsion platform for imaging guided therapy evaluated in experimental cancer. ACS Nano. 5, 4422-4433 (2011).
- Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nat Rev Drug Discov. 4, 145-160 (2005).
- Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44, 924-938 (2016).
- Perez-Medina, C., et al. In Vivo PET Imaging of HDL in Multiple Atherosclerosis Models. JACC Cardiovasc Imaging. 9, 950-961 (2016).
- Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nature communications. 5, 3065 (2014).
- Carney, B., et al. Non-invasive PET Imaging of PARP1 Expression in Glioblastoma Models. Mol Imaging Biol. , (2015).
- Salinas, B., et al. Radioiodinated PARP1 tracers for glioblastoma imaging. EJNMMI Res. 5, 123 (2015).
- Carlucci, G., et al. Dual-Modality Optical/PET Imaging of PARP1 in Glioblastoma. Mol Imaging Biol. 17, 848-855 (2015).
- Tang, J., et al. Immune cell screening of a nanoparticle library improves atherosclerosis therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , (2016).
- Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J.
- Goodwill, P., et al. X-space MPI: magnetic nanoparticles for safe medical imaging. Adv Mater. 24, 3870-3877 (2012).
