Udvikling af<em> Metarhizium anisopliae</em> Som Mycoinsecticide: Fra Isolation til Field Performance
Summary
Her rapporterer vi de forskellige faser, der er involveret i den videnbaserede udvikling af et effektivt mycoinsekticid, herunder isolering, identifikation, screening og udvælgelse af "best fit" entomopathogenic svampen, Metarhizium anisopliae , til bekæmpelse af skadedyr i landbruget .
Abstract
En stor bekymring ved udviklingen af kommercielle mycoinsecticider er killhastigheden sammenlignet med kemiske insekticider. Isolering og screening til udvælgelsen af en hurtigtvirkende, stærkt virulent entomopatogen svamp er derfor vigtige trin. Entomopatogene svampe, som Metarhizium, Beauveria og Nomurea , som virker ved kontakt, er bedre egnet end Bacillus thuringiensis eller nukleopolyhedrosisvirus (NPV), som skal indtages af insektspest. I det nuværende arbejde isolerede vi 68 Metarhizium- stammer fra inficerede insekter ved hjælp af en jordfortyndings- og agnemetode. Isolaterne blev identificeret ved amplifikation og sekventering af ITS1-5.8S-ITS2 og 26S rDNA-regionen. Den mest virulente stamme af Metarhizium anisopliae blev udvalgt baseret på median dødelig koncentration (LC 50 ) og tid (LT 50 ) opnået i insekt bioassays mod III-instar larver af Helicoverpa armigera.Masseproduktionen af sporer ved den udvalgte stamme blev udført med fermentering i fast tilstand (SSF) under anvendelse af ris som et substrat i 14 dage. Sporer blev ekstraheret fra sporuleret biomasse ved anvendelse af 0,1% tween-80, og forskellige formuleringer af sporer blev fremstillet. Feltforsøg af formuleringerne til kontrol af en H. armigera- angreb i duetter blev udført ved randomiseret blokdesign. Infestationskontrolniveauerne opnået med olie og vandige formuleringer (henholdsvis 78,0% og 70,9%) var bedre end 63,4% opnået med kemisk pesticid.
Introduction
Fra indførelsen af organiske chlorpesticider i 1940'erne i Indien er brugen af pesticider steget mange gange 1 , hvor afgrøde skadedyr stadig koster milliarder rupier 2 årligt med hensyn til udbyttetab i landbrugsproduktionen. Den udbredte og ikke-dømmende anvendelse af syntetiske pesticider er en kontinuerlig trussel mod miljøet og menneskers sundhed 1 . Den utilsigtede brug af pesticider fører til rester i jorden og udtømning af naturligt skadedyr. Det tjener også som et kraftigt valgpres for at ændre den genetiske sminke af en skadedyrsbekæmpelse, hvilket fører til udvikling af resistens 1 . På trods af de enorme fordele ved den grønne revolution, som krævede høje input, som gødninger og pesticider, er skadedyr fortsat en stor biotisk begrænsning. Et generelt skøn over registrerede årlige afgrøde i Indien og i verden er USD 12 miaEf "> 2 og USD 2.000 milliarder 3 henholdsvis.
Når kemiske pesticider har skadelige virkninger, når de bruges til bekæmpelse af skadedyr, bliver det afgørende at søge alternative metoder, der er økologisk sunde, pålidelige, økonomiske og bæredygtige. Biologisk kontrol giver et passende alternativ og omfatter anvendelse af parasitter, rovdyr og mikrobielle patogener 4 . Svampe er for eksempel kendt for at inficere en bred vifte af skadedyrsskadedyr, herunder lepidopteraner, hymenopteraner, coleopteraner og dipteraner, der ofte resulterer i naturlige epizootier. I modsætning til andre bakterielle og virale insektkontrolmidler er handlingsmåden af insektpatogene svampe endvidere ved kontakt 5 . Disse svampe omfatter en heterogen gruppe på over 100 slægter, med ca. 750 arter rapporteret blandt forskellige insekter. De vigtige svampepatogener er: Metarhizium sp., Beauveria sP., Nomuraea rileyi , Lecanicillium lecanii og Hirsutella sp. For at nævne nogle få 6 . M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin er den anden mest anvendte entomopatogene svamp i biokontrol. Det er kendt at angribe over 200 arter af insekter 7 .
I denne undersøgelse præsenteres forskellige stadier involveret i den videnbaserede udvikling af et mycopesticid ved anvendelse af M. anisopliae . Dette omfatter: 1) identifikation af en kilde ( dvs. jord eller mycosed insekter) til virulent entomopathogener, 2) entomopathogen identifikation og udvælgelse, 3) strategier for at opretholde deres virulente natur og effektivitet i laboratorie bioassay og på området 4 ) Den omkostningseffektive formulering af infektive propagler, 5) udviklingen af unikke kvalitetsstyringsparametre til virulent præparation, og 6) bioprospektering og værditilsætning.
Protocol
Representative Results
Discussion
I løbet af 1880'erne blev det første forsøg på at bruge Metarhizium til at kontrollere scaraberbenet , Anisoplia austriaca og sukkerroercurculio, Cleonis punctiventris 21 . I denne protokol var en af forudsætningerne at isolere en virulent stamme, enten fra jorden eller fra inficerede insekter. Faktisk har andre parametre, såsom LC 50 , LT 50 og ST 50 , bidraget væsentligt til omkostningseffektiviteten af …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender bidrag fra samarbejdspartnere fra det bioteknologiske institut for indo-schweizisk samarbejde i bioteknologi (ISCB) fra Institut for Bioteknologi, New Delhi og Det Schweiziske Agentur for Udvikling og Samarbejde, Bern, Schweiz. Bidragene fra projektstuderende og personale involveret i udviklingen af mycoinsekticidet, herunder Vandana Ghormade, Pallavi Nahar, Priya Yadav, Shuklangi Kulkarni, Manisha Kapoor, Santosh Chavan, Ravindra Vidhate, Shamala Mane og Abhijeet Lande, anerkendes. EKP og SGT takker University Grants Commission, Indien og Scientific and Industrial Research (CSIR), Indien, henholdsvis for forskning stipendier. MVD anerkender støtten fra Rådet for Industriel og Videnskabelig Forskning, New Delhi for Emeritus Scientist Scheme. Forfatterne er taknemmelige for Institut for Bioteknologi, New Delhi, Indien for den økonomiske støtte under ISCB og SBIRI programmerne. Vi er taknemmelige forKorrekturlæsere for deres input.
Materials
| Agar | Hi-Media | RM666 | Reagent |
| Ammonium sulphate | Thomas Baker | 11645 | Reagent |
| DNA analyzer | Applied biosystem | ABI prism 3730 | Instrument |
| DNA islation kit | Qiagen | 69104 | Reagent |
| Dodine | Sigma | 45466 | Reagent |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28604 | Reagent |
| Glucose | Hi-Media | GRM077 | Reagent |
| Knapsac sparyer | Kaypee | HY-16L (1004) | Instrument |
| Peptone | Hi-Media | RM006-500G | Reagent |
| Polypropylene vials | Laxbro | SV-50 | Plasticware |
| Potato dextrose agar (PDA) | Hi-Media | M096-500G | Reagent |
| Tween-80 | SRL | 28940 | Reagent |
| Ultra low volume sparyer | Matabi | INSECDISK | Instrument |
| Unicorn-bags | Unicorn | UP-140024-SMB | Autoclavalbe bag for SSF |
| Yeast extract | Hi-Media | RM027-500G | Reagent |
| Chromas 2.1 | software |
References
- Aktar, M. W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
- Dhaliwal, G. S., Jindal, V., Mohindru, B. Crop losses due to insect pests: Global and Indian scenario. Indian J Entomol. 77 (2), 165-168 (2015).
- Popp, J., Peto, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2015).
- van Lenteren, J. C., Manzaroli, G., Albajes, R., Gullino, M. L., van Lenteren, J. C., Elad, Y. Evaluation and use of predators and parasitoids for biological control of pests in greenhouses. Integrated pest and disease management in greenhouse crops. , 183-201 (1999).
- Charnley, A. K., Collins, S. A., Kubicek, C. P., Druzhinina, I. S. Entomopathogenic fungi and their role in pest control. The Mycota IV: Environmental and Microbial Relationships. , 159-187 (2007).
- Deshpande, M. V., MV, D. e. s. h. p. a. n. d. e., et al. Comparative evaluation of indigenous fungal isolates, Metarhizium anisopliae M34412, Beauveria bassiana B3301 and Nomuraea rileyi N812 for the control of Helicoverpa armigera (Hüb.) on pulses. Proceeding of the international workshop on entomopathogenic fungi – a valuable alternative to fight against insect pests. , 51-59 (2004).
- Roberts, D. W., Hajek, A. E., Leathan, G. F. Entomopathogenic fungi as bioinsecticides. Frontiers in industrial mycology. , 144-159 (1992).
- Goettel, M., Inglis, G. D., Lacey, L. A. . Fungi: Hyphomycetes. Manual of techniques in insect pathology. , 213-245 (1996).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., Innis, M. A. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR-Protocols: A guide to methods and applications. , 315-322 (1990).
- Ignoffo, C. M., Futtler, B., Marston, N. L., Hostetter, D. L., Dickerson, W. A. Seasonal incidence of the entomopathogenic fungus Spicaria rileyi associated with noctuid pests of soybeans. J Invertebr Pathol. 25 (1), 135-137 (1975).
- Abbott, W. S. A method for computing the effectiveness of an insecticide. J Econ Entomol. 18 (2), 265-267 (1925).
- Nahar, P. . Development of biocontrol agents for the control of pests in agriculture using chitin metabolism as target. , 137 (2004).
- Kulkarni, S. A., et al. Comparison of Metarhizium isolates for biocontrol of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in chickpea. Biocontrol Sci Tech. 18 (8), 809-828 (2008).
- Jeffs, L. B., Khachatourians, G. G. Estimation of spore hydrophobicity for members of the genera Beauveria, Metarhizium, and Tolypocladium by salt-mediated aggregation and sedimentation. Can J Microbiol. 43 (1), 23-28 (1997).
- Henderson, C. F., Tilton, E. W. Tests with acaricides against the brow wheat mite. J Econ Entomol. 48 (2), 157-161 (1955).
- Hassani, M. . Development and proving of biocontrol methods based on Bacillus thuringiensis and entamopathogenic fungi against the cotton pests Spodoptera littoralis, Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae). , (2000).
- Enkerli, J., Ghormade, V., Oulevey, C., Widmer, F. PCR-RFLP analysis of chitinase genes enable efficient genotyping of Metarhizium anisopliae var. anisopliae. J Invert Pathol. 102 (2), 185-188 (2009).
- Bidochka, M. J., Melzer, M. J. Genetic polymorphism in three subtilisin-like protease isoforms (Pr1A, Pr1B and Pr1C) from Metarhizium strains. Can. J. Microbiol. 46 (12), 1138-1144 (2000).
- McCoy, C. W., Samson, R. A., Boucias, D. G., Ignoffo, C. M., Mandava, N. B. Entomogenous fungi. Handbook of natural pesticides, Microbial insecticides, Part A. Entomogenous protozoa and fungi. , 151-236 (1988).
- Nahar, P. B., et al. Effect of repeated in vitro sub-culturing on the virulence of Metarhizium anisopliae against Helicoverpa armigera (Lepidoptera Noctuidae). Biocontrol Sci Tech. 18 (4), 337-355 (2008).
- Kapoor, M., Deshpande, M. V. Development of mycoinsecticide for the control of insect pests: Issues and challenges in transfer of technology from laboratory to field. Kavaka. 40, 45-56 (2013).
- Deshpande, M. V. Mycopesticide Production by Fermentation: Potential and Challenges. Crit Rev Microbiol. 25 (3), 229-243 (1999).
