細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム<em>結核菌</em
Summary
我々は、細胞内および細胞内のブロス増殖する細菌、ならびに哺乳動物宿主細胞に対する細胞毒性を標的、 結核菌に対する新規化合物を発見するためのモジュラーハイスループットスクリーニングシステムを開発しました。
Abstract
Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.
Introduction
結核菌 、結核（TB）の原因物質は、世界中の罹患率と死亡率の主要な原因です。薬物感受性TBは、6ヶ月の期間にわたって複数の抗生物質を必要とする治療可能な疾患です。治療可能な疾患であるにもかかわらず、結核死亡率は、2015年1における150万と推定されました。過去10年間で、薬剤耐性結核の有病率に対する懸念が高まっています。多剤耐性結核（MDR-TB）は、少なくともイソニアジド（INH）、及びリファンピシン（RMP）、最もMDR-TB株は、このように治療の選択肢を制限する、第二のラインTB薬を選択することも耐性があるに耐性のあるTBのように定義されます。薬剤耐性の効果は、患者のヒト免疫不全ウイルス（HIV）で同時感染を治療するために大きな課題を作成します。 40万患者は世界中で2015 1でHIV関連結核で死亡しました。残念なことに、米国食品医薬品Administ配給は、過去40年間2に、MDR-TB、bedaquilineに対する唯一の新しい結核治療薬を承認しました。より良いと短いTBの治療法を見つけるの進歩が緊急TBとMDR-TBとの戦いに先に滞在するために必要とされています。
伝統的に、TB薬物スクリーニングは、化合物が成長している培養物に添加し、微生物を根絶におけるそれらの有効性は、固体培地上のコロニー形成単位（CFU）をカウントすることによって決定されることにより、増殖培地中でインビトロ増殖条件下で行われます。 CFU数は労働集約的、時間がかかり、かつ高価であるように、様々な間接的な方法は、この問題を軽減するために開発されています。そのような方法は、アラマーブルー生存率アッセイ3、緑色蛍光タンパク質（GFP）またはルシフェラーゼを発現する細菌からの発光5からの蛍光4の決意、および全アデノシン三リン酸の推定（Aを含みますTP）6、7。
典型的なTBは、細菌は肺胞マクロファージ8のファゴソーム内部に存在し、複製肺の結核菌の感染によって特徴付けられます。シンプルな中ブロス表現型の画面は、細胞外病原体に合うこと。しかし、歴史的な観点では、この方法を用いて同定された結核菌に対する化合物は、多くの場合、感染モデルにおける下流の検証ステップの間、期待に応えるに失敗ヒット。私たちは、結核治療薬は、最高の細胞内宿主細胞の感染モデルで実行されていることを提案します。それにも関わらず、細胞内のモデルは、ハイスループットスクリーニング（HTS）の開発に多くの技術および生物学的障壁を保有します。大きなハードルは多くの工程と洗浄の間で-による細胞外細菌の精巧な除去によって例示される、感染プロセスの複雑さです。第二の主要なハードルは、長い時間の再ですquirementsは、通常CFU培養プレート上でカウントすることによって行わ増殖検出として、完了するまでに3週間以上を要するプロセスです。 CFUカウントを交換する1つの解決策は、蛍光細菌との組み合わせで自動化された蛍光顕微鏡によって提供されています。しかし、この解決策は、多くの研究室のための手の届かないところにある初期の設備投資が必要となります。シンプル、低コスト、および疾患関連HTS方法を大幅に創薬プロセスを高めるであろう。
本研究では、細胞内の結核菌に対する化合物の活性を決定するのに適した、迅速、かつ拡張性の高い、まだ経済的、アッセイを提供することを目的とする新しい、モジュラーHTSシステムを報告しています。 （I）細胞内、（ii）の細胞毒性、および（iii）中のブロスアッセイ：このシステムは、三つのモジュールから構成されています。合わせた最終的な結果は、作用の潜在的なモードなどの追加情報と、化合物の特性の包括的な説明を提供します。このSCreeningシステムは、薬物相乗作用9の分析、オートファジー10の刺激、および結核菌 -secreted毒性因子（未発表）の阻害を含む作用機序を標的とする様々な化合物ライブラリー、といくつかのプロジェクトで使用されてきました。アクションの未知のモードの化合物はまた、11を研究されています。この方法の修正版は、細胞内結核菌 11に対して新規な化合物を同定するための一次スクリーニング法としての産業パートナーによって採択されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究の目標は、 結核菌のための人間の細胞内感染モデルを使用して、シンプルでコスト効率のHTS方法を作成することでした。結核は、 結核菌によって肺胞マクロファージの感染によって特徴付けられるヒト疾患です。バイオセーフティ問題に、細菌と宿主細胞の両方の生物学的モデルを含む研究は過去に使用されてきました。しかし、サロゲート細菌および非ヒトモデルの?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by BC Lung Association and Mitacs.
Materials
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
| Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
| Albumin, Bovine pH7 | Affymetrix | 10857 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP350 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
| kanamycin sulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
| 1M Hydrocholoric acid (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 351269 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
| Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| M. tuberculosis H37Rv | |||
| 96-well flat bottom white plate | Corning | 3917 | |
| 95-well flat bottom clear plate | Corning | 3595 | |
| Transparent plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
| Microplate spectrophotometer | Biotek | Epoch | |
| luminometer | Applied Biosystems | Tropix TR717 |
References
- WHO. . Global tuberculosis report 2015. , (2016).
- Yajko, D. M., et al. Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).
- Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).
- Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence. J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).
- Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).
- Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1, 57 (2010).
- Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis. Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).
- Ramon-Garcia, S., et al. Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen. Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).
- Lam, K. K., et al. Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog. 8, e1002691 (2012).
- Sorrentino, F., et al. Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62, 158-165 (2009).
- . THP-1 (ATCC TIB-202) Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx (2016)
- Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).
- Invitrogen. . AlamarBlue assay. , (2008).
- . Handbook of anti-tuberculosis agents. Introduction. Tuberculosis (Edinb). 88 (2), 85-86 (2008).
- Riss, T. L., et al. . Cell Viability Assays. , (2004).
- Meyer, M., et al. In vivo efficacy of apramycin in murine infection models. Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).
- Ballell, L., et al. Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis. ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).
- Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice. FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).
- Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).
- Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B. Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).
- Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. . The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , 147-159 (2015).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. J Vis Exp. , e51960 (2014).
- Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid. Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).
- Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria. PLoS One. 5, e10777 (2010).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. , e51114 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2′ epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5, e1000645 (2009).
- Pethe, K., et al. Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis. Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).
