Mammalcellekapsling i alginatperler ved hjelp av et enkelt omrørt fartøy

Summary

Denne videoen og manuskriptet beskriver en emulsjonsbasert metode for innkapsling av pattedyrceller i 0,5% til 10% alginatperler som kan fremstilles i store batcher ved bruk av en enkel omrørt beholder. De innkapslede celler kan dyrkes in vitro eller transplanteres for cellulære terapiapplikasjoner.

Abstract

Celleinnkapsling i alginatperler har vært brukt for immobilisert cellekultur in vitro, så vel som for immunoisolering in vivo . Innkapsling av bukspyttkjertelen er studert omfattende som et middel for å øke isletes overlevelse i allogene eller xenogene transplantasjoner. Algininkapsling oppnås vanligvis ved dyseekstrudering og ekstern gelering. Ved hjelp av denne metoden faller celleholdige alginatdråper dannet ved spissen av dyser inn i en løsning som inneholder divalente kationer som forårsaker ionotrop alginat gelering som de diffunderer i dråpene. Kravet på dråpeformasjon ved dysespissen begrenser volumetrisk gjennomstrømning og alginatkonsentrasjon som kan oppnås. Denne video beskriver en skalerbar emulgeringsmetode for å inkapslere pattedyrceller i 0,5% til 10% alginat med 70% til 90% celleoverlevelse. Ved denne alternative metode emulgeres alginatdråper inneholdende celler og kalsiumkarbonat i mineralolje, folSenket av en reduksjon i pH som fører til intern kalsiumfrigivelse og ionotrop alginat gelering. Den nåværende metoden tillater fremstilling av alginatperler innen 20 minutter av emulgering. Utstyret som kreves for innkapslingstrinnet, består i enkle omrørte kar som er tilgjengelige for de fleste laboratorier.

Introduction

Mammalcelleinnkapsling har blitt bredt studert som et middel for å beskytte transplanterte celler fra immunavstøtning ¹ eller for å gi en tredimensjonal støtte for immobilisert cellekultur ^{2 , 3 , 4} . Bukspyttkjertelinnkapsling i alginatperler har blitt brukt til å reversere diabetes i allogene ^{5 , 6} eller xenogene ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} gnagere. Prækliniske og kliniske studier av innkapslet pankreas-øktransplantasjon for å behandle type 1-diabetes pågår ^{13 , 14 , 15} . For transplantasjonsapplikasjoner eller større skalEn in vitro immobilisert celleproduksjon, dysebaserte perlegeneratorer, blir generelt brukt. Vanligvis pumpes en blanding av alginat og celler gjennom en dyse for å danne dråper som faller i en omrørt oppløsning inneholdende divalente kationer, noe som resulterer i den eksterne gelering av dråpene. Koaksialgasstrømmen ^{16 , 17} , dysevibrering ¹⁸ , elektrostatisk avstøtning ¹⁹ eller roterende ledninger ²⁰ letter dråpedannelse ved dysespissen.

De viktigste ulempene ved konvensjonelle vulstgeneratorer er deres begrensede gjennomstrømning og det begrensede området av løsningsviskositeter som vil resultere i tilstrekkelig perleformasjon ²¹ . Ved høye strømningshastigheter bryter væsken som kommer ut av dysen opp i dråper som er mindre enn dysediameteren, og reduserer størrelsesreguleringen. Multi-nozzle bead generatorer kan brukes til å øke gjennomstrømningen, menDen ensartede fordeling av strømmen mellom dysene og bruken av løsninger> 0.2 Pas er problematisk ²² . Til slutt forventes alle dysebaserte enheter å forårsake noen skade på øyer, siden diameteren av dysene som brukes er mellom 100 μm og 500 μm, mens ~ 15% av menneskelige øyer kan være større enn 200 μm ²³ .

I denne videoen beskriver vi en alternativ metode for innkapsling av pattedyrceller ved å danne dråper i et enkelt emulgeringstrinn i stedet for drop-by-drop. Siden beadproduksjonen utføres i et enkelt omrørt kar, er metoden egnet for liten (~ 1 ml) til storskala (10 ³ L-serie) perleproduksjon med lave utstyrskostnader ²⁴ . Denne metoden tillater fremstilling av perler med høy sfærisk form ved bruk av et bredt spekter av alginatviskositeter med korte ( f.eks. 20 min) perlegenereringstider. Denne metoden ble opprinnelig utviklet av Poncelet et al. ^{25 , 26} og pleide å immobilisere DNA ²⁷ , proteiner ²⁸ innbefattende insulin ²⁹ og bakterier ³⁰ . Vi har nylig tilpasset disse metodene til innkapslingen av pattedyrceller ved bruk av pankreas-betacellelinjer ^{31 , 32} og primær pankreasvev ³² .

Prinsippet med metoden er å danne en vann-i-olje emulsjon bestående av alginatdråper i mineralolje, etterfulgt av intern gelering av alginatdråper ( figur 1 ). Først blir inkapslingsmiddelet ( f.eks. Celler) dispergert i en alginatoppløsning inneholdende et fint kornkalsiumsalt med lav oppløselighet ved den første prosess-pH. Alginatblandingen blir så tilsatt til en omrørt organisk fase for å danne en emulsjon, vanligvis i nærvær av aoverflateaktivt middel. I tilfelle av pattedyrcellekapsling kan komponenter som er tilstede i serum virke som overflateaktive midler. Deretter reduseres pH for å oppløseliggjøre kalsiumsaltet ved å tilsette en oljeoppløselig syre som skiller seg i vannfasen. Eddiksyre, med en mineralolje / vann-partisjonskoeffisient <0,005 ³³ , bør foroppløses i olje, deretter tilsatt emulsjonen hvor den blandes i oljefasen og skiller seg raskt i vannfasen ³⁴ . Figur 2 illustrerer de kjemiske reaksjonene og diffusjonen som finner sted under forsurende og indre geleringstrinn. Til slutt utvinnes de innkapslede celler ved faseinversjon, faseseparasjon akselerert ved sentrifugering, gjentatte vaske-trinn og filtrering. Disse trinnene kan deretter følges av perle- og celleprøvetaking for kvalitetskontrollanalyser, in vitro- cellekultur og / eller transplantasjon av de innkapslede celler.

<p clasS = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1">
Figur 1: Skjematisk av emulgeringsbasert prosess for innkapsling av pattedyrceller. Perler fremstilles først ved å emulgere en alginat, celle og CaCO3-blanding i mineralolje (trinn 1 og 2 i skjematisk), utløsende intern gelering ved å tilsette eddiksyre (trinn 3). De gelerte perler separeres deretter fra oljen ved å tilsette en vandig buffer for å utløse faseinversjon (trinn 4), etterfulgt av sentrifugering og olje-aspirering (trinn 5) og deretter filtrering (trinn 6). Til slutt overføres perlene oppsamlet på filteret til cellekulturmedium for in vitro- kultur eller transplantasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

<imgAlt = "Figur 2" class = "xfigimg" src = "/ files / ftp_upload / 55280 / 55280fig2.jpg" />
Figur 2: Reaksjoner og diffusjonstrinn som oppstår under intern gelering. (1) Eddiksyre tilsettes til den organiske fasen og transporteres til alginatdråpene ved konveksjon. (2) Eddiksyre fordeler seg i vannfasen. (3) I nærvær av vann dissocierer og diffuserer syren for å nå CaCO _3- kornene som er avbildet i mørk blå. (4) H ⁺ -jonene utveksles med Ca2 ⁺ -ioner i CaCO3, frigjør Ca2 ⁺ -ioner. (5) Kalsiumioner diffunderer til de møter uomsatt alginat, som fører til ionotrop kryssbinding av alginatkjedene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

I motsetning til konvensjonelle dysebaserte celleinnkapslere er en bred perlestørrelsesfordeling eksponertCted fra denne prosessen på grunn av mekanismen for dråpedannelse i omrørt emulgering. For en delmengde av applikasjoner, kan denne perlestørrelsesfordelingen være problematisk. For eksempel kan en større brøkdel av celler bli eksponert ved vulstoverflaten i mindre perler. Hvis næringsstoffer ( f.eks. Oksygen) begrensninger er en bekymring, kan disse begrensningene forverres i større perler. En fordel ved den omrørte emulgeringsmetode er at gjennomsnittlig vulststørrelse lett kan justeres ved å endre omrøringshastigheten under emulgeringstrinnet. Breddistribusjonsfordelingen kan også utnyttes for å studere effekten av perlestørrelse på innkapslet celleytelse.

Mammalisk celleinnkapsling ved emulgering og intern gelering er et interessant alternativ for laboratorier som ikke er utstyrt med en vulstgenerator. Videre gir denne metoden brukere muligheten til å redusere behandlingstiden eller generere perler ved svært lav eller meget høy alginatkoncentreringasjon.

Protokollen beskrevet nedenfor beskriver hvordan man skal innkapslere celler i 10,5 ml 5% alginatløsning fremstilt i 10 mM 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES) buffer. Alginatet består av en 50:50 blanding av transplantasjonskvalitet LVM (lav viskositet høy mannuronsyreinnhold) og MVG (medium viskositet høy guluronsyreinnhold) alginat. Kalsiumkarbonat i en sluttkonsentrasjon på 24 mM brukes som det fysiske tverrbindingsmiddel. Lett mineralolje utgjør den organiske fasen, mens eddiksyre brukes til å syre emulsjonen og utløse intern gelering. Imidlertid er alginatypen og -blandingen, så vel som den valgte prosessbuffer, avhengig av den ønskede anvendelse ³² . En rekke alginattyper (se tabell over materialer) har blitt brukt til å produsere perler med denne protokollen.

Protocol

1. Forbered Alginate Solution, CaCO 3 Suspension og Syret Olje Forbered prosessbufferen og mediumet. Forbered den typiske prosessbufferen som brukes til å generere høykonsentrasjonsalginatperler ved bruk av 10 mM HEPES, 170 mM NaCl. Juster pH til 7,4. Forbered det typiske dyrkingsmediet ved bruk av Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) som inneholder 10% føtalt bovint serum (FBS), 6 mM glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin. </o…

Representative Results

Ved slutten av emulgerings-og intern geleringsprosessen, bør et vulstvolum lik det innledende alginat og celleblandingsvolumet utvinnes. Perlene bør være svært sfæriske med få feil ( figur 3 ). Perlene skal være tilstrekkelig sterke til å tåle pipettering gjennom storboringspipetter. Ved høye alginatkonsentrasjoner kan innkapslede olje- eller luftdråper observeres i perlene. Dette oppstår sannsynligvis på grunn av innfesting av olje i algi…

Discussion

Ulike trinn (vist i figur 2 ) under den interne geleringsreaksjonen kan begrense den totale kinetikken. For kalsiumkarbonatkorn større enn ~ 2,5 μm, har karbonatoppløsningen vist seg å være begrensningsbegrensende ^{26 , 44} . Syringstrinnet som fører til intern kalsiumfrigivelse har også vist seg å være den kritiske prosessvariabel som påvirker celleoverlevelse ³² . Betingelsene som fører til intern gelering er d…

Materials

Reagents and consumables
LVM alginate (transplantation-grade)	Novamatrix	Non-applicable	Referred to as "alginate #1" in the results.
MVG alginate (transplantation-grade)	Novamatrix	Non-applicable	Referred to as "alginate #2" in the results.
Alginate (cell culture-grade)	Sigma	A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity)	A2033 is referred to as "alginate #3" in the results.
DMEM	Life Technologies	11995-065
Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin	Thermo Fisher Scientific	SH3039603
Glutamine	Life Technologies	25030
Penicillin and streptomycin	Sigma	P4333-100ML
HEPES, cell culture tested	Sigma	H4034-100G
NaCl	Thermo Fisher Scientific	S271-1
Fine-grain CaCO3	Avantor Materials	1301-01	After preparing the CaCO3 suspension, sonicate and use within one month.
Light mineral oil	Thermo Fisher Scientific	O121-4	Sterile filter through a 0.22 μm pore size membrane prior to use.
Glacial acetic acid	Thermo Fisher Scientific	A38-500	Handle with caution: refer to MSDS.
Sterile spatulas	Sigma	CLS3004-100EA
Sterile nylon cell strainers, 40 µm	Thermo Fisher Scientific	08-771-1
Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)	Sarstedt	86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001
Pasteur pipettes	VWR	14673-043
Toluidine Blue-O	Sigma	T3260
Equipment
100 mL microcarrier spinner flasks	Bellco	1965-00100	The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet.
Magnetic stir plate with adjustable speed	Bellco	7760-06005	The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use.
Cell counter	Innovatis	Cedex AS20	This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer.
LED light box	Artograph	LightPad® PRO	This item can be replaced by other types of illuminators.
Handheld camera	Canon	PowerShot A590 IS	A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images.
Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters	Olympus	IX81	Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives.
Image aquisition software	Molecular Devices	Metamorph	A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images.
Image analysis freeware	CellProfiler	Non-applicable	A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ).