Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.
Den konstruktive biologi og syntetisk biologi tilnærming til å skape kunstig liv involvere bottom-up montering av biologiske eller ikke-biologiske materialer. Slike tilnærminger har fått stor oppmerksomhet i forskning på grensen mellom levende og nonliving saken og har blitt brukt til å konstruere kunstige celler i løpet av de siste to tiårene. Spesielt har Giant vesikler (Gvs) ofte blitt anvendt som kunstige cellemembraner. I denne artikkelen beskriver vi utarbeidelse av GVS innkapsle svært pakket sfærer som en modell av celler som inneholder kondenserte biomolekyler. De Gvs ble fremstilt ved hjelp av en enkel vann-i-olje-emulsjon sentrifugeringsmetoden. Nærmere bestemt ble en homogenisator brukt til å emulgere en vandig oppløsning inneholdende materialet som skal innkapsles og en olje som inneholder oppløste fosfolipider, og den resulterende emulsjon ble lagt forsiktig på overflaten av en annen vandig oppløsning. Den lagdelte Systemet ble deretter sentrifugert to generere GVS. Denne kraftige metoden ble brukt til å kapsle materialer fra små molekyler til mikrosfærer.
Den konstruktive, eller syntetisk, biologi tilnærming er en fascinerende avenue for å utforske grensen mellom levende og ikke-levende materie. Fordi cellen er minimum enhet er nødvendig for liv slik vi forstår nå det, ulike forskere har forsøkt å konstruere kunstige celler fra enkle, godt forstått kjemikalier slik at fenomener som oppstår i slike kunstige celler kan studeres, med det endelige målet med å belyse livets opprinnelse og studere de grunnleggende funksjonene i levende celler 1, 2, 3. Spesielt blemmer 4, som er sfæriske microcompartments laget av amfifile molekyler og kan innkapsle biologiske molekyler, slik som proteiner, 5, 6 og DNA-7, 8, 9,lass = "xref"> 10, har ofte blitt brukt som modeller av biologiske membraner.
Vesiklene kan klassifiseres som små (definert som å ha en diameter på <100 nm), store (diameter <1 um), eller giant (diameter> 1 um). Giant vesikler (Gvs) er blitt studert i stor utstrekning, fordi de ligner på levende celler i størrelse, form og struktur. På grunn av størrelsen på Gvs kan morfologiske forandringer i GV membraner lett kan observeres i sann tid under et optisk mikroskop.
Flere fremgangsmåter for fremstilling av Gvs har blitt rapportert 11, inkludert det hydrering metode 12, 13, fryse-tine-metoden 14, den electroformation metode 15, 16, og den fluidiske enheten fremgangsmåten 17, 18. Imidlertid innkapslende proteiner og andre MACROMolecules i GVS ved høye konsentrasjoner ved hjelp av disse metodene er vanskelig. Spesielt er det ekstremt vanskelig å innkapsle biologisk materiale i tilstrekkelig mengde (20-30 vol%) for å etterligne den overfylt miljø inne i cellene 19, 20. For å danne Gvs umiddelbart, Weitz og medarbeidere etablert en vann-i-olje (w / o) emulsjon sentrifugeringsmetoden 21, 22. Denne metoden har fem viktige funksjoner. For det første fordi Gvs fremstilt ved denne metoden har lav lamellarity 23, 24, deres membraner er så tynne at de kan deformeres lett. GV membran deformasjon fremkalt av FtsZ (en bakteriecelledelingen protein), tubulin, og andre makromolekyler er blitt studert 25, 26, 27, 28, og vi har observert polyhe Dron lignende deformasjoner av GV membraner indusert ved innkapsling av mikrokuler 29, 30. For det andre, kan membranproteiner settes inn i vesikulær membranen ved denne fremgangsmåten, om enn med vanskeligheter 31. For eksempel, den Yomo gruppen brukt denne metoden til å studere in vitro syntese og pore-dannende aktivitet av membranprotein α-hemolysin 32. For det tredje er det mulig å generere asymmetriske Gvs hvori lipidkomponentene i de indre og ytre brosjyrer er forskjellige 22. For eksempel Whittenton et al. genererte asymmetriske GVS med kationiske lipider i indre pakningsvedlegget å kapsle negativt ladet polynukleotider, og med nøytrale lipider på den ytre pakningsvedlegget for å redusere toksisitet og uspesifikke cellulært opptak 33. For det fjerde kan konsentrasjonen og volumfraksjonen av stoffene inne i Gvs være relativt høys = "xref"> 28, 34. Femte, kan flere typer materialer som skal innkapsles 35. For eksempel, Nishimura et al. innkapslet en in vitro transkripsjon-translasjonssystem i Gvs og brukes i systemet for å gi uttrykk for grønt fluorescerende protein (GFP) i Gvs 36. Disse fem funksjonene gjør w / o emulsjon sentrifuge en uunnværlig metode for generering av celleligne GVS.
I tidligere arbeid, ble Gvs generert ved sentrifugering oppsamlet ved hjelp av en sprøyte utstyrt med en lang 16 G nål av rustfritt stål inneholdende noe av den endelige vandige oppløsning 22. I hendene på uerfarne teknikere, kan denne metode for å hente lett resultere i forurensning av GV med noe av oljen. I denne studien har vi brukt w / o emulsjon sentrifugering protokoll utviklet av Yomo gruppen 23, 37,hvori utfelte Gvs samles gjennom et hull åpnet i bunnen av sentrifugerøret i hvilket de er fremstilt. Vi forberedte GVS innkapsle 1,0 mikrometer mikrosfærer, som er omtrent samme størrelse som intracellulære organeller. Anvendelse av mikrokuler tillot oss å beregne konsentrasjonen ved beregning av deres volumfraksjon. Etablering av en metode for utarbeidelse av GVS hvor materialene er tettpakket er et viktig skritt for å skape kunstige celler. For å bekrefte nytten av vår protokoll for ulike typer indre materialer, vi også vist at GFP og et lite vannløselig fluorescerende molekyl (uranine) kunne innkapslet i GVS.
Egenvektene til den indre vandige dispersjonsmediet og den ytre vandige oppløsningen må velges nøye. For v / o-emulsjon for å felle ut i det ytre vandige oppløsning under sentrifugering, må den spesifikke vekt av den indre vandige dispersjon medium være større enn den til den ytre vandige oppløsning. Vi har forsøkt å fremstille Gvs ved hjelp av indre og ytre løsninger uten sukker, men vi oppnådd ingen Gvs under disse betingelser, fordi den indre vandige løsningen ikke har nok masse til å krysse interferens mellom de to faser. Hvis det er en stor osmotisk trykkforskjell mellom de to oppløsningene, Gvs som utfelles i den ytre vandige oppløsningen kan krympe eller brudd. Derfor må det osmotiske trykket i og utenfor GVS være like. For å oppnå dette, brukes vi sukrose som et oppløst stoff i den indre vandige dispersjon og glukose som et oppløst stoff i den ytre vandige oppløsningen; både sukker var ved samme konsentrasjon. både saltss = "xref"> 22 og sukker 23, 35, 38 har vært brukt for slike formål, men sukker anvendes vanligvis fordi det er mindre toksiske og mer oppløselig enn salt. Imidlertid, hvis for mye sukker blir tilsatt, kan Gvs komme i kontakt med undersiden av dekkglass og kollaps. Det er flere strategier for å unngå dette. En strategi er å redusere den spesifikke vekt forskjellen mellom de indre og ytre vandige oppløsninger, slik at Gvs utfelles under milde betingelser; spesielt kan supernatanten av det utfelte GV dispersjonen utveksles med en oppløsning som er identisk til den indre vandige oppløsningen for å redusere muligheten for brudd vesikulært ved adhesjon til glasset som følge av oppdrift. En annen strategi er å forbelegget begge dekkglass med en tynn lipid film 29.
Riktig fremstilling og inkubering av emulsjonenviktig. Vi brukte flytende parafin for å fremstille oljeoppløsning. Mineralolje 26, 31, dodekan 21, 33, og squalan 33, er 39 også ofte brukt som oppløsningsmiddeloljer. Fordi disse materialene varierer i spesifikk vekt, viskositet og overflatespenning, forskjellig antall vesikler dannes selv når de samme sentrifugeringsbetingelser er benyttet 33. For å oppnå vesiklene med target-egenskaper, er det viktig å optimalisere egenvekt og viskositet av de indre og ytre vandige oppløsninger, så vel som den sentrifugale acceleration.For fremstilling av oljefasen, må forekomme inkubering ved høy temperatur og i en tørr miljø slik som en inkubator eller en dehydrator. I denne studien vi oppvarmet flytende parafin til 80 ° C for fullstendig å oppløse lipidet molecules.In Videre bør emulsjonenfremstilles bare etter behov og bør umiddelbart underkastet sentrifugering fordi det er ustabilt like etter at den er fremstilt og v / o-dråpene lett smelter sammen til hverandre. Emulsjonen kan fremstilles i store mengder ved sonikering, vortexblanding, eller tapping. Men ved hjelp av en homogenisator muliggjør hurtig fremstilling av store mengder av emulsjon og enklere emulgering i olje med høy viskositet. Det er også viktig at emulsjonen legges lagvis på den ytre vandige oppløsningen forsiktig og hurtig, og deretter avkjølt ved 4 ° C. For å forkorte tiden mellom emulgering og sentrifugering, kan den olje ytre vandig oppløsning system bli forhåndsavkjølt før emulsjonen er lagdelt på den, og hele systemet kan deretter sentrifugeres immediately.If den hvite uklarhet vises raskere eller langsommere enn vanlig, mekanisk homogenisator må skylles for å fjerne vaskemidler. I tillegg, før emulgering, må oljeoppløsning, indre vandig oppløsning, og emulgator være returned til romtemperatur.
Riktig sentrifugalakselerasjonen er også viktig. Ved sentrifugering ved 18 000 x g, var vi i stand til å forberede GVS med et enkelt interiør materiale innkapslet i en høy konsentrasjon. Når innkapslingen av flere materialer som er nødvendig, er det bedre å redusere sentrifugalakselerasjonen. For eksempel ble et actin monteringssystem innkapsling av syv forbindelser som oppnås med sentrifugering på mindre enn 350 x g 35. I tilfeller hvor sentrifugering er uønsket, kan Gvs oppnås ved justering av sukkerkonsentrasjonen, eller ved utfelling av emulsjonen under påvirkning av sin egen masse 38, 40, 41.
Den metode som er rapportert heri har to viktige begrensninger. Den ene er at oljemolekylene (parafin, i dette tilfellet) kan bli oppløst i GV membranen, slik det er blitt påpekt av Weitz gruppe 21. Ved innsetting av et membranprotein inn i GV membranen er ønsket, må effekten av ko-eksisterende oljemolekylene på proteinet bli vurdert. Den andre begrensningen er variasjonen av volumfraksjon. I denne studien, beregnet vi at volumandelene av mikrokuler i den Gvs varierte 4-30 vol%; volumandelene var ikke identiske med volumfraksjonen av den indre vandige oppløsning som anvendes for fremstilling GV. Selv om vi var i stand til å innkapsle mikrokuler i Gvs ved en volumfraksjon høy nok for mikroskopi observasjon, er denne metoden ikke egner seg for fremstilling av Gvs med en ensartet volumfraksjon fordeling. Det har blitt rapportert at fordelingen av mikrokulevolumfraksjoner endres under sentrifugeringen 34.
W / o-emulsjon sentrifugeringsmetoden er vanligvis brukes for dannelsen av Gvs inneholdende innkapslede materialer. Imidlertid har noen rapporter beskrev poppreisning fra GVS innkapsle mikroskala materialer 34, 42. Nylig har molekyl roboter som inneholder et innkapslet DNA-enhet eller en molekylær enhet er bygget 43, 44. GVS med avdelinger er førstevalget for slike programmer; derfor kan teknikker, for eksempel vårt, som kan brukes for innkapsling av magnetiske mikrokuler og mikrokuler med forskjellige overflatefunksjonalisering kan forventes å være anvendbare 44.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Tomoko Yamaguchi for tegning skjematisk bilde i figur 1. Denne studien ble støttet av Okazaki ORION prosjekt Okazaki Institute for Integrative Biovitenskap av theNational Institutes of Natural Sciences (nins); ved astrobiologi Senter Project (ingen AB281010.) av Nins; av en Grant-in-Aid for Scientific Research på innovative områder (Dynamisk bestilling av biomolekylære systemer for etablering av integrerte funksjoner) fra Japan Society for Promotion of Science (JSP) (ingen 25102008.); av en Grant-in-Aid for Unge Forskere (B) (til KK, ingen 15K17850.) fra JSP; Andby en Grant-in-Aid for forskningsvirksomhet på Start-Up (for å YN, nei. 15H06653) fra JSP. Ekstra støtte ble gitt av en bevilgning fra Noguchi Institute, et stipend fra Kao Foundation for Arts and Sciences, og et stipend fra Kurita Vann og miljø Foundation.
REAGENTS: | |||
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
Liquid paraffin | Wako Pure Chemical Industries | 128-04375 | Oil, Density (20℃) 0.86 -0.89 g/mL |
1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EQUIPMENT: | |||
Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy micro-homogenizer |
Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470-495 nm Emission filter: 510-550 nm |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565–585 nm Emission filter: 600-690 nm |