The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.
यह पत्र एक microfluidic एक एम्बेडेड पॉली कार्बोनेट (पीसी) रासायनिक ऑक्सीजन और ढ़ाल के संयोजन के तहत सेल प्रवास का अध्ययन करने के लिए पतली फिल्म के साथ polydimethylsiloxane (PDMS) से बने उपकरण रिपोर्ट। दोनों रासायनिक और ऑक्सीजन ढ़ाल बहुत विवो में सेल प्रवास को प्रभावित कर सकते हैं; हालांकि, तकनीकी सीमाओं के कारण, बहुत कम शोध इन विट्रो में उनके प्रभाव की जांच करने के लिए किया गया है। डिवाइस इस अनुसंधान के क्षेत्र में विकसित टेढ़ा के आकार चैनलों वांछित रासायनिक ढ़ाल उत्पन्न करने के लिए की एक श्रृंखला का लाभ लेता है और ऑक्सीजन ढाल पीढ़ी के लिए एक स्थानिक सीमित रासायनिक प्रतिक्रिया विधि का लाभ उठाते। रासायनिक ऑक्सीजन और ढ़ाल के निर्देशों एक दूसरे से सीधा सीधा प्रवास परिणाम व्याख्या सक्षम करने के लिए कर रहे हैं। ताकि कुशलता से कम से कम रासायनिक खपत के साथ ऑक्सीजन ढ़ाल उत्पन्न करने के लिए, एम्बेडेड पीसी पतली फिल्म एक गैस प्रसार बाधा के रूप में उपयोग किया जाता है। विकसित microfluidic युक्तिसिरिंज पंप से प्रेरित और सेल प्रवास प्रयोगों के दौरान एक पारंपरिक सेल इनक्यूबेटर में रखा सेटअप सरलीकरण और अनुकूलित सेल संस्कृति शर्तों के लिए अनुमति देने के लिए किया जा सकता है। सेल प्रयोगों में, हम, adenocarcinomic मानव वायुकोशीय बेसल उपकला कोशिकाओं, A549 के माइग्रेशन का अध्ययन करने के केमोकाइन के संयोजन के तहत (stromal सेल व्युत्पन्न कारक, एसडीएफ 1α) और ऑक्सीजन ढ़ाल डिवाइस का इस्तेमाल किया। प्रयोगात्मक परिणाम बताते हैं कि डिवाइस स्थिरतापूर्वक सीधा केमोकाइन और ऑक्सीजन ढ़ाल पैदा करते हैं और कोशिकाओं के साथ संगत है सकते हैं। प्रवास का अध्ययन परिणामों से संकेत मिलता है कि ऑक्सीजन ढ़ाल के तहत ढ़ाल के संयोजन एकल ढ़ाल के तहत उन लोगों से की भविष्यवाणी नहीं की जा सकती है सेल प्रवास का मार्गदर्शन में एक आवश्यक भूमिका, और सेलुलर व्यवहार निभा सकते हैं। डिवाइस सेल संस्कृति में रासायनिक ऑक्सीजन और ढ़ाल के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए शोधकर्ताओं के लिए एक शक्तिशाली और व्यावहारिक उपकरण है, जो अधिक विवो तरह microenvi में बेहतर सेल प्रवास के अध्ययन को बढ़ावा देने के कर सकते हैं प्रदान करता हैronments।
घुलनशील कारकों और ऑक्सीजन तनाव के स्थानिक वितरण विवो 1, 2, 3, 4 में महत्वपूर्ण सेलुलर कार्यों की एक संख्या को नियंत्रित कर सकते। ताकि बेहतर कोशिकाओं पर उनके प्रभाव की जांच करने के लिए, इन विट्रो सेल संस्कृति मंच स्थिरतापूर्वक रासायनिक ऑक्सीजन और ढ़ाल पैदा करने में सक्षम अत्यधिक वांछित है। विभिन्न घुलनशील कारकों जैविक गतिविधियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और सेलुलर व्यवहार प्रभावित करते हैं। हाल ही में, microfluidic तकनीक की उन्नति के कारण, microfluidic स्थिरतापूर्वक पैदा रासायनिक ढ़ाल के लिए सक्षम उपकरणों की एक संख्या सेल प्रवास 5 अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। इसके अलावा, कई अध्ययनों से यह भी इन विट्रो सेल संस्कृतियों 6, 7, 8 के लिए ऑक्सीजन तनाव की आवश्यकता पता चला है। तथापि,सेल संस्कृति के लिए ऑक्सीजन तनाव के नियंत्रण मुख्य रूप से दबाव गैस सिलेंडरों के साथ ऑक्सीजन सफाई या सेल इन्क्यूबेटरों के लिए प्रत्यक्ष रासायनिक इसके अलावा इस पर निर्भर करता है। प्रत्यक्ष रासायनिक इसके अलावा सेल संस्कृति के माध्यम से बदल और सेलुलर प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करता है। ऑक्सीजन नियंत्रण इन्क्यूबेटरों विशेष इनक्यूबेटर डिजाइन, सटीक गैस प्रवाह नियंत्रण, और आदेश हाइपोक्सिया की स्थिति को प्राप्त करने में नाइट्रोजन गैस की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, यह इस सेटअप है, जो विभिन्न ऑक्सीजन तनाव और ढ़ाल के तहत सेलुलर व्यवहार का अध्ययन अवरूद्ध का उपयोग कर ऑक्सीजन के स्थानिक वितरण को नियंत्रित करने के अव्यवहार्य है। इन सीमाओं को पार करने के लिए, microfluidic उपकरणों की एक संख्या सेल संस्कृति अनुप्रयोगों 9 के लिए ऑक्सीजन ढ़ाल उत्पन्न करने के लिए विकसित किया गया है। हालांकि, उनमें से ज्यादातर दबाव गैसों, जो वाष्पीकरण और बुलबुला पीढ़ी समस्याओं का कारण बन सकता है का उपयोग कर संचालित कर रहे हैं। इसलिए, वे अक्सर परिष्कृत उपकरण की आवश्यकता होती है और लंबे समय तक सेल संस्कृति अध्ययन के लिए विश्वसनीय नहीं हो सकताएस।
चुनौतियों पर काबू पाने के लिए और आगे सेल प्रवास के लिए रासायनिक ऑक्सीजन और ढ़ाल के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए, हम एक microfluidic सेल संस्कृति एक एम्बेडेड पॉली कार्बोनेट (पीसी) पतली फिल्म 10 के साथ polydimethylsiloxane (PDMS) के बने डिवाइस विकसित की है। डिवाइस दो microfluidic चैनल परतें एक PDMS झिल्ली द्वारा अलग से बना है। ऊपर परत ऑक्सीजन ढाल पीढ़ी के लिए एक PDMS-पीसी परत है; नीचे की परत रासायनिक ढाल पीढ़ी और सेल संस्कृति के लिए PDMS से बना है। डिवाइस एक साथ गैस सिलेंडरों और परिष्कृत प्रवाह नियंत्रण प्रणाली का उपयोग किए बिना सीधा रासायनिक ऑक्सीजन और ढ़ाल उत्पन्न कर सकते हैं। डिवाइस में, PDMS महान ऑप्टिकल पारदर्शिता, गैस पारगम्यता, और सेल संस्कृति और इमेजिंग के लिए जैविक अनुकूलता प्रदान करता है। एम्बेडेड पीसी फिल्म कुशल ऑक्सीजन तनाव नियंत्रण के लिए एक गैस प्रसार बाधा के रूप में कार्य करता है। microfluidic चैनल में, हम टेढ़ा के आकार का चैनल की एक श्रृंखला के लिए इस्तेमाल कियारासायनिक ढ़ाल उत्पन्न करते हैं। डिजाइन मोटे तौर पर अपनी विश्वसनीयता और आसान प्रयोगात्मक स्थापना के कारण विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए microfluidic उपकरणों में रासायनिक ढ़ाल उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, रासायनिक ढाल प्रोफाइल संख्यात्मक सिमुलेशन के साथ पहले से चैनल geometries अलग से बनाया जा सकता है। ऑक्सीजन ढाल पीढ़ी के लिए, हम स्थानिक सीमित रासायनिक प्रतिक्रिया तरीका है कि पहले से हमारी प्रयोगशाला में 10, 11, 12 में विकसित किया गया था का फायदा उठाया। ऑक्सीजन नाइट्रोजन मिटाने के बिना निर्दिष्ट क्षेत्रों द्वारा खा जा सकता है। जैविक प्रयोगशालाओं में व्यावहारिक उपयोग के लिए, पूरे प्रयोगात्मक स्थापना पारंपरिक सेल संस्कृति इन्क्यूबेटरों के साथ संगत है। इन तरीकों को एकीकृत करके, हम एक साथ सेल प्रवास का अध्ययन करने के क्रम में थोक गैस सिलेंडर और परिष्कृत उपकरण के बिना स्थिर रासायनिक ऑक्सीजन और ढ़ाल उत्पन्न कर सकते हैं।
एक एम्बेडेड पीसी पतली फिल्म के साथ PDMS microfluidic युक्ति निर्माण करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: (1) सभी बुलबुले को खदेड़ने जब PDMS में पूर्व बहुलक पीसी फिल्म डालने जबकि PDMS-पीसी ऊपर परत fabricating और (2) सुनिश्चित कर रही है सभी PDMS प्रक्रियाओं के इलाज के लिए एक अच्छी तरह से समतल क्षैतिज विमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं। सेल प्रवास प्रयोगों के लिए, सबसे महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: (1) microfluidic युक्ति के भीतर बुलबुले को नष्ट करने, प्रयोगों के दौरान ट्यूबिंग, और सिरिंज पंप; (2) यह सुनिश्चित करना कि microfluidic युक्ति सेल प्रवास के अवलोकन के लिए जीना सेल इमेजिंग के दौरान एक अच्छी तरह से लगाया क्षैतिज विमान पर रखा गया है; और (3) डिवाइस प्रयोगों के दौरान DDH 2 हे पेट्री डिश को जोड़ने और सुनिश्चित करें कि पानी बाहर सूख नहीं है बनाकर moisturized रखने।
आदेश में सफलतापूर्वक delamination बिना PDMS-पीसी संकर microfluidic युक्ति बनाना करने के लिए, यह पीसी फाई के दौरान सभी बुलबुले को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण हैएल एम प्रविष्टि। पीसी फिल्म धीरे-धीरे पूर्व बहुलक PDMS में पीसी फिल्म की प्रविष्टि के दौरान बुलबुले पीढ़ी को रोकने के लिए एक कोण से डाला जा सकता है (पूर्व बहुलक PDMS सतह से लगभग 15 से 30 डिग्री की दूरी पर)। यदि आवश्यक हो, पूरे PDMS एम्बेडेड पीसी फिल्म के साथ पूर्व बहुलक फंस बुलबुले को निष्कासित करने के लिए 10 मिनट के लिए वैक्यूम पंप से जुड़ा desiccator में रखा जा सकता है। पीसी फिल्म वैक्यूम प्रक्रिया के बाद ऊपर तैरता है, तो एक विंदुक टिप ठीक PDMS परत पर पीसी फिल्म नीचे प्रेस करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वैक्यूम और प्रेस प्रक्रियाओं को दोहराएँ यदि आवश्यक है।
सेल प्रयोगों के लिए, हवा के बुलबुले की कमी microfluidic सेल संस्कृति के लिए महत्वपूर्ण है। सुनिश्चित करें कि कोई हवाई बुलबुले पूरे microfluidic सेटअप जब कनेक्शन बनाने (सिरिंज पंप, ट्यूबिंग, और microfluidic युक्ति सहित) में पेश कर रहे हैं। हवा के बुलबुले अनुभव का ऊंचा तापमान के तहत गैस घुलनशीलता की कमी की वजह से microfluidic सेटअप के भीतर बनाई गई हैं, तोमशीन के अंदर riments, सभी प्रयोगात्मक और अभिकर्मकों (मध्यम विकास सहित pyrogallol, और NaOH) (सीरिंज और ट्यूबिंग सहित) घटकों इनक्यूबेटर में पहले से (उपयोग करने के लिए कम से कम 20 मिनट पहले) तापमान भिन्नता को कम करने के लिए रखा जा सकता है । सिरिंज पंप अक्सर भीतर मोटर्स के संचालन से गर्मी पैदा पंप। यह आमतौर पर इन्क्यूबेटरों अंदर सिरिंज पंप संचालित करने के लिए स्वीकार्य है; हालांकि, प्रयोगों के दौरान इनक्यूबेटर तापमान की जांच करना। तापमान प्रयोगों के दौरान उठ हैं, तो अतिरिक्त ठंडा प्रक्रियाओं बाहर ले जाने की जरूरत है। कई संभव ठंडा करने के तरीकों ऐसे इनक्यूबेटर में बर्फ की एक बॉक्स रखने, इनक्यूबेटर के अंदर रखा सिरिंज पंप की संख्या को कम करने, या एक बल शीतलन प्रणाली के साथ एक मशीन का उपयोग कर के रूप में, नियोजित किया जा सकता है।
PDMS-पीसी microfluidic सेल संस्कृति इस पत्र में विकसित डिवाइस मज़बूती से सीधा रासायनिक ऑक्सीजन और ढ़ाल के लिए पैदा करने में सक्षम हैआर सेल प्रवास अध्ययन करता है। विकसित उपकरण की सीमा यह है कि उत्पन्न ऑक्सीजन ढाल प्रोफाइल माध्यम में डिवाइस के माध्यम से, परिवेश वातावरण से ऑक्सीजन प्रवाह, रासायनिक प्रतिक्रिया सफाई द्वारा संचालित है, और ऑक्सीजन प्रसार के बीच संतुलन पर निर्भर करती है, और है। नतीजतन, ऑक्सीजन ढाल प्रोफाइल मनमाने ढंग से डिवाइस के अंदर नियंत्रित नहीं किया जा सकता है। मौजूदा microfluidic सेल संस्कृति प्लेटफार्मों की तुलना में, डिवाइस इस पत्र में विकसित पहले एक रासायनिक ऑक्सीजन और ढ़ाल के संयोजन के तहत सेल संस्कृति के अध्ययन प्रदर्शन करने में सक्षम है। पूरे डिवाइस थकाऊ संरेखण और महंगा इंस्ट्रूमेंटेशन के बिना पारंपरिक नरम लिथोग्राफी प्रतिकृति मोल्डिंग प्रक्रिया का उपयोग कर गढ़े जा सकते हैं। ढ़ाल संख्यानुसार प्रेरित किया जा सकता है और प्रयोगात्मक इन विट्रो सेल के अध्ययन के लिए अधिक शारीरिक microenvironment जैसी स्थिति प्रदान करने के लिए होती है। एक गैस di के रूप में एक पीसी फिल्म के साथ एक स्थानिक सीमित रासायनिक प्रतिक्रिया पद्धति का उपयोग करकेffusion बाधा, ऑक्सीजन ढाल दबाव गैस सिलेंडरों और परिष्कृत गैस प्रवाह नियंत्रण इकाइयों का उपयोग किए बिना उत्पन्न किया जा सकता है। इसके अलावा, सेटअप (प्रति दिन कम से कम 10 एमएल) रसायनों की ही छोटी मात्रा में ऑक्सीजन ढ़ाल बनाए रखने के लिए की आवश्यकता है। चूंकि ऑक्सीजन तनाव नियंत्रण microfluidic चैनल के चारों ओर स्थानीय स्तर पर ही सीमित है, और परिवेश ऑक्सीजन एकाग्रता परेशान नहीं करता है, पूरे सेटअप अतिरिक्त तापमान, आर्द्रता के बिना एक पारंपरिक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर के अंदर रखा जा सकता है, और सीओ 2 नियंत्रण उपकरण। नतीजतन, विकसित डिवाइस महान क्षमता व्यावहारिक रूप से जैविक प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया जा रहा है।
तकनीकी सीमाओं के कारण, ऑक्सीजन तनाव के तहत सेलुलर व्यवहार शायद ही कभी मौजूदा साहित्य में अध्ययन किया गया है। इस पत्र में विकसित इस उपकरण की मदद के साथ, ऑक्सीजन ढ़ाल के तहत सेल संस्कृति एक सतही तरीके से कि बहुत ऑक्सीजन ढ़ाल के तहत सेल के अध्ययन को बढ़ावा देता में प्रदर्शन किया जा सकता है। furthermore, एक समान आपरेशन सिद्धांत के लिए इन विट्रो सेल संस्कृति 17 अध्ययन, जैसे कार्बन डाइऑक्साइड और नाइट्रिक ऑक्साइड के रूप में अन्य physiologically प्रासंगिक गैसीय ढ़ाल, उत्पन्न करने के लिए लागू किया जा सकता है। इन क्षमताओं है कि PDMS-पीसी microfluidic युक्ति, औषधि परीक्षण और सेल प्रसार और प्रवास assays सहित विभिन्न सेल संस्कृति अनुप्रयोगों के लिए महान क्षमता का पता चलता विट्रो सेल संस्कृति के अध्ययन में अग्रिम करने के लिए प्रदर्शित करता है।
The authors have nothing to disclose.
This paper is based on work supported by the National Health Research Institutes (NHRI) in Taiwan under the Innovative Research Grant (IRG) (EX105-10523EI), the Taiwan Ministry of Science and Technology (MOST 103-2221-E-001-001-MY2, 104-2221-E-001-015-MY3, 105-2221-E-001-002-MY2), the Academia Sinica Thematic Project (AS-105-TP-A06), and the Research Program in Nanoscience and Nanotechnology. The authors would like to thank Ms. Rachel A. Lucas for proofreading the manuscript.
1 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302104 | |
1.5 ml Microcentrifuge Tube | Smartgene | 6011-000 | |
10 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302151 | |
15 ml Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Falcon 352096 | |
150 mm Petri-Dish | Dogger Science | DP-43151 | |
1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltrichlorosilane | Alfa Aesar, Ward Hill, MA | 78560-45-9 | |
3 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302118 | |
4'' Silicon Dummy Wafer | Wollemi Technical, Taoyuan, Taiwan | ||
Acetone | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | AH3102-000000-72EC | |
AG Double Expose Mask Aligner | M&R Nano Technology, Taoyuan, Taiwan | AG500-4D-D-V-S-H | |
Antibiotic-Antimyotic solution | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 15240-062 | |
Biopsy punch | Miltex, Plainsboro, NJ | 33-31 | |
Blunt needle | JensenGlobal, Santa Barbara, CA | Gauge 14 | |
Bright-Line Hemocytometer | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | Z359629 | for cell counting |
Buffered Oxide Etch | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | PH3101-000000-72EC | |
Cell Culture Incubator | Caron, Marietta, OH | 6016-1 | |
COMSOL Multiphysics | COMSOL, Burlington, MA | Ver. 4.3b | for numerical simulation of chemical gradients in the device |
D-PBS | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 14190-144 | |
Desicattor | A-VAC Industries, Anaheim, CA | 35.10001.01 | |
DMEM/ F12+GlutaMax-1 | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 10565-018 | |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 10082 | |
Fibronectin from Human Plasma | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | F2006 | |
Inverted Fluorescence Microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMIL LED | |
Isopropyl Alcohol (IPA) | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | CMOS112-00000-72EC | |
JuLi Smart Fluorescence Cell Imager | NanoEnTek, Seoul, Korea | DBJ01B | |
Mechanical Convention Oven | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Lindberg Blue M MO1450C | |
NaOH | Showa Chemical Industry, Tokyo, Japan | 1943-0150 | |
Plasma tretment system | Nordson MARCH, Concord CA | PX-250 | for oxygen plasma surface treatment |
Polycarbonate (PC) film | Quantum Beam Technologies, Tainan Taiwan | ||
Polydimehtylsiloxane (PDMS) | Dow Corning, Midland, MI | SYLGARD 184 | |
Pyrogallol | Alfa Aesar, Ward Hill, MA | A13405 | |
Removable Adhesive Putty | 3M | 860 | |
Sorvall Legend Mach 1.6R Tabletop Centrifuge | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | ||
Spin Coater | ELS Technology, Hsinchu, Taiwan | ELS 306MA | |
SU-8 2050 | MicroChem, Westborough, MA | SU-8 2050 | |
SU-8 Developer | MicroChem, Westborough, MA | Y020100 | |
Surgical blade | Feather, Osaka, Japan | 5005093 | for PDMS cutting |
Syringe Pump | Chemyx, Houston, TX | Fusion 400 | |
T75 Cell Culture Flask | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Nunc 156367 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | 15250061 | |
Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 25200 | |
Tygon PTFE Tubing | Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH | ||
Tygon Tubing | Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH | 621 |