The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.
Detta dokument redovisar en mikroflödessystem enhet tillverkad av polydimetylsiloxan (PDMS) med en inbäddad polykarbonat (PC) tunnfilms att studera cell migration enligt kombinationer av kemiska och syre gradienter. Både kemiska och syre gradienter kan kraftigt påverka cellmigration in vivo; men på grund av tekniska begränsningar, mycket lite forskning har utförts för att undersöka deras effekter in vitro. Anordningen utvecklats i denna forskning utnyttjar en serie av serpentin-formade kanaler för att generera de önskade kemiska gradienter och utnyttjar en rumsligt begränsad kemisk reaktion metod för syre gradient generation. Riktningarna för de kemiska och syre gradienter är vinkelräta mot varandra för att möjliggöra enkel migration resultat tolkning. För att effektivt generera syre gradienter med minimal kemikalieförbrukning, är den inbyggda PC tunn film används som en gas diffusionsbarriär. Den utvecklade mikrofluidikanordningkan påverkas av sprutpumpar och placeras i en konventionell cellinkubator under cellmigrations experiment för att möjliggöra inställnings förenkling och optimerade cellodlingsbetingelser. I cellförsök har vi använt enheten att studera migrering av adenocarcinomic mänskliga alveolära basal epitelceller, A549, enligt kombinationer av kemokin (stromal derived faktor, SDF-1α) och syre gradienter. De experimentella resultaten visar att anordningen stabilt kan alstra vinkelräta kemokin och syre gradienter och är kompatibel med cellerna. Migrationsstudieresultaten tyder på att syre gradienter kan spela en viktig roll i att vägleda cellmigration och cell beteende under kombinationer av gradienter kan inte förutsägas från de under enstaka gradienter. Anordningen ger ett kraftfullt och praktiskt verktyg för forskare att studera interaktioner mellan kemiska och syre gradienter i cellkultur, som kan främja bättre studier cell migration som mer in vivo -liknande microenvijöer.
Den rumsliga fördelningen av lösliga faktorer och syrespänningen kan reglera ett antal viktiga cellulära funktioner in vivo 1, 2, 3, 4. För att bättre kunna undersöka deras effekt på celler, är en in vitro cellkultur plattform förmåga att stabilt alstra kemiska och syre gradienter högst önskvärt. Olika lösliga faktorer spelar nyckelroller i biologiska aktiviteter och påverka cellbeteende. Nyligen, på grund av utvecklingen av mikroflödesteknik, ett antal mikroflödessystem enheter kan stabilt generera kemiska gradienter har utvecklats för att studera cell migration 5. Dessutom har flera studier också visat att det är nödvändigt att syrespänningen för in vitro-cellkulturer 6, 7, 8. Dock,kontroll av syrgastryck för cellodling bygger huvudsakligen på direkt kemisk tillsats för syreuppsamlande eller cell inkubatorer med tryck gasflaskor. Direkt kemisk tillsats förändrar cellkulturmediet och påverkar de cellulära svar. Syrekontroll inkubatorer kräver särskild inkubator utformning, exakt gasflöde kontroll, och en stor volym av kvävgas i syfte att uppnå hypoxi förhållanden. Dessutom är det omöjligt att styra den geografiska fördelningen av syre med hjälp av denna inställning, som hämmar den cellulära beteende studien under olika syretryck och gradienter. För att övervinna dessa begränsningar, har ett antal mikroflödessystem enheter har utvecklats för att generera syre gradienter för cellodlingstillämpningar 9. Dock de flesta av dem drivs med gaser under tryck, vilket kan orsaka avdunstning och bubbel generationens problem. Därför kräver de ofta sofistikerad instrumentering och kan inte vara tillförlitliga för långsiktig cellodling studies.
För att övervinna de utmaningar och att ytterligare studera samspelet mellan kemiska och syre gradienter för cellmigration, har vi utvecklat en mikroflödessystem cellodlingsanordning tillverkad av polydimetylsiloxan (PDMS) med en inbäddad polykarbonat (PC) tunn film 10. Anordningen är sammansatt av två mikroflödeskanallager separerade av en PDMS-membran. Det översta skiktet är ett PDMS-PC skikt för syre gradient generering; bottenskiktet är gjort av PDMS för kemisk gradient generering och cellodling. Enheten kan samtidigt generera vinkelräta kemiska och syre gradienter utan att använda gasflaskor och sofistikerade flödeskontroll system. I anordningen ger PDMS stor optisk transparens, gaspermeabilitet, och biologisk kompatibilitet för cellodling och bildbehandling. Den inbäddade PC filmen fungerar som en gas diffusionsbarriär för effektiv syrespänningskontroll. I mikroflödeskanalen, använde vi en serie av serpentin-formad kanals för att generera kemiska gradienter. Designen har i stort sett utnyttjas för att generera kemiska gradienter i mikroflödessystem enheter för olika applikationer på grund av dess pålitlighet och lätt experimentuppställning. Dessutom kan den kemiska lutning profiler utformas genom att variera kanalgeometrier i förväg med numerisk simulering. För syre lutning generation, vi drog fördel av den rumsligt begränsade kemisk reaktion metod som tidigare utvecklats i vårt labb 10, 11, 12. Syret kan rensas från de utvalda områdena utan kväve rensning. För praktisk användning i biologiska labs, är hela experimentuppställning kompatibel med konventionella cellodlings inkubatorer. Genom att integrera dessa metoder, kan vi samtidigt skapa stabila kemiska och syre gradienter utan bulk gasflaskor och sofistikerade instrument för att studera cell migration.
De mest kritiska stegen för att tillverka PDMS mikroflödessystem enhet med en inbäddad PC tunn film är: (1) utvisa alla bubblor när du sätter i PC-film i PDMS pre-polymer, medan tillverkning av PDMS-PC toppskikt och (2) att se till alla PDMS härdningsprocesser utförs på en väl planade horisontalplanet. För cellmigrations experiment de mest kritiska stegen är: (1) eliminera bubblorna inom mikroflödessystem enhet, slangar och sprutpumpar under experimenten; (2) Se till att mikroflödessystem enheten placeras på en väl planade horisontalplanet under levande cell imaging för cellmigration observation; och (3) att hålla enheten återfuktad genom att tillsätta DDH 2 O till petriskål under experimenten och se till att vattnet inte torkas ut.
För att framgångsrikt tillverka PDMS-PC hybrid mikroflödessystem enhet utan delaminering, är det viktigt att ta bort alla bubblor under PC film införing. PC filmen kan införas långsamt från en vinkel (ungefär 15 till 30 grader bort från PDMS pre-polymerytan) för att förhindra bubblor generation under införandet av PC-filmen in i PDMS prepolymerpartiklarna. Om så är nödvändigt kan hela PDMS-prepolymer med den inbäddade PC-film placeras i exsickatorn ansluten till vakuumpumpen under 10 min för att driva ut de infångade bubblor. Om PC-film flyter upp efter vakuumprocessen, kan en pipettspets användas för att trycka ner PC filmen på det härdade PDMS lagret. Upprepa vakuum- och pressprocesser vid behov.
För cellexperiment, en brist på luftbubblor är kritisk för mikroflödescellkulturen. Se till att inga luftbubblor införs i hela mikroflödes setup (inklusive sprutpumpar, slangar och mikroflödessystem enhet) när du gör anslutningarna. Om luftbubblor skapas inom mikroflödesinställnings på grund av minskningen av gas löslighet under den förhöjda temperaturen av erfarenriments inuti inkubatorn, kan alla experimentella komponenter (inklusive de sprutor och slangar) och reagens (inklusive tillväxtmediet, pyrogallol, och NaOH) placeras i inkubatorn i förväg (minst 20 min före användning) för att minimera temperaturvariation . Sprutpumpar ofta generera värme från driften av motorerna inom pumparna. Det är oftast acceptabelt att driva sprutpumpar i inkubatorer; emellertid gör kontrollera inkubatortemperaturen under experimenten. Om temperaturen höjer under experimenten, ytterligare kylning förfaranden måste genomföras. kan användas flera genomförbara kylmetoder, såsom att placera en låda med is in i inkubatorn, minska antalet sprutpumpar placeras inuti inkubatorn, eller med användning av en inkubator med en kraft kylsystem.
PDMS-PC mikroflödescellodlingsanordning utvecklats i detta dokument är i stånd att på ett tillförlitligt sätt generera vinkelräta kemiska och syre gradienter for studier cell migration. Begränsningen av den utvecklade anordningen är att de alstrade syre lutning profiler beror på balansen mellan syreflödet, som drivs av kemisk reaktion sophantering, och syrediffusion från den omgivande atmosfären, genom anordningen, och i mediet. Som ett resultat, de syre gradient Profiler kan inte godtyckligt styras inuti anordningen. Jämfört med befintliga mikroflödescellodlings plattformar, är anordningen som utvecklats i detta dokument den första som kan utföra cellodlingsstudier enligt kombinationer av kemiska och syre gradienter. Hela anordningen kan tillverkas med hjälp av konventionella mjuk litografi replik gjutprocessen, utan omständlig justering och dyr instrumentering. De gradienter kan numeriskt simuleras och experimentellt präglas för att ge mer fysiologiska mikroliknande förhållanden för in vitro studier cell. Genom att använda en rumsligt begränsad kemisk reaktion metod med en PC-film som en gas diffusion barriär, kan genereras syre lutning utan att använda tryck gasflaskor och sofistikerade gasflödet styrenheter. Dessutom kräver installationen endast små mängder av kemikalier (mindre än 10 ml per dag) för att upprätthålla syre gradienter. Eftersom syrespänningsregleringen begränsas lokalt runt mikroflödessystem kanal, och inte stör den omgivande syrehalt kan hela installationen placeras inuti en konventionell cellodling inkubator utan extra temperatur, luftfuktighet och CO 2 kontroll instrumentering. Som ett resultat har den utvecklade anordningen stor potential att användas praktiskt i biologiska laboratorier.
På grund av tekniska begränsningar, har cellulära beteenden under syre spänningar sällan studerats i den existerande litteraturen. Med hjälp av anordningen som utvecklats i detta dokument, kan utföras cellodling under syre gradienter på ett enkelt sätt som i hög grad främjar cellstudier under syre gradienter. furthermore kan en liknande princip operation tillämpas för att generera andra fysiologiskt relevanta gasformiga gradienter, såsom koldioxid och kväveoxid, för in vitro cellkulturstudier 17. Dessa funktioner visar att PDMS-PC mikroflödessystem enhet visar stor potential för olika cellodlingsapplikationer, inklusive drogtestning och celltillväxt och migration analyser att avancera in vitro cellodlingsstudier.
The authors have nothing to disclose.
This paper is based on work supported by the National Health Research Institutes (NHRI) in Taiwan under the Innovative Research Grant (IRG) (EX105-10523EI), the Taiwan Ministry of Science and Technology (MOST 103-2221-E-001-001-MY2, 104-2221-E-001-015-MY3, 105-2221-E-001-002-MY2), the Academia Sinica Thematic Project (AS-105-TP-A06), and the Research Program in Nanoscience and Nanotechnology. The authors would like to thank Ms. Rachel A. Lucas for proofreading the manuscript.
1 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302104 | |
1.5 ml Microcentrifuge Tube | Smartgene | 6011-000 | |
10 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302151 | |
15 ml Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Falcon 352096 | |
150 mm Petri-Dish | Dogger Science | DP-43151 | |
1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltrichlorosilane | Alfa Aesar, Ward Hill, MA | 78560-45-9 | |
3 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302118 | |
4'' Silicon Dummy Wafer | Wollemi Technical, Taoyuan, Taiwan | ||
Acetone | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | AH3102-000000-72EC | |
AG Double Expose Mask Aligner | M&R Nano Technology, Taoyuan, Taiwan | AG500-4D-D-V-S-H | |
Antibiotic-Antimyotic solution | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 15240-062 | |
Biopsy punch | Miltex, Plainsboro, NJ | 33-31 | |
Blunt needle | JensenGlobal, Santa Barbara, CA | Gauge 14 | |
Bright-Line Hemocytometer | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | Z359629 | for cell counting |
Buffered Oxide Etch | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | PH3101-000000-72EC | |
Cell Culture Incubator | Caron, Marietta, OH | 6016-1 | |
COMSOL Multiphysics | COMSOL, Burlington, MA | Ver. 4.3b | for numerical simulation of chemical gradients in the device |
D-PBS | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 14190-144 | |
Desicattor | A-VAC Industries, Anaheim, CA | 35.10001.01 | |
DMEM/ F12+GlutaMax-1 | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 10565-018 | |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 10082 | |
Fibronectin from Human Plasma | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | F2006 | |
Inverted Fluorescence Microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMIL LED | |
Isopropyl Alcohol (IPA) | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | CMOS112-00000-72EC | |
JuLi Smart Fluorescence Cell Imager | NanoEnTek, Seoul, Korea | DBJ01B | |
Mechanical Convention Oven | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Lindberg Blue M MO1450C | |
NaOH | Showa Chemical Industry, Tokyo, Japan | 1943-0150 | |
Plasma tretment system | Nordson MARCH, Concord CA | PX-250 | for oxygen plasma surface treatment |
Polycarbonate (PC) film | Quantum Beam Technologies, Tainan Taiwan | ||
Polydimehtylsiloxane (PDMS) | Dow Corning, Midland, MI | SYLGARD 184 | |
Pyrogallol | Alfa Aesar, Ward Hill, MA | A13405 | |
Removable Adhesive Putty | 3M | 860 | |
Sorvall Legend Mach 1.6R Tabletop Centrifuge | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | ||
Spin Coater | ELS Technology, Hsinchu, Taiwan | ELS 306MA | |
SU-8 2050 | MicroChem, Westborough, MA | SU-8 2050 | |
SU-8 Developer | MicroChem, Westborough, MA | Y020100 | |
Surgical blade | Feather, Osaka, Japan | 5005093 | for PDMS cutting |
Syringe Pump | Chemyx, Houston, TX | Fusion 400 | |
T75 Cell Culture Flask | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Nunc 156367 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | 15250061 | |
Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 25200 | |
Tygon PTFE Tubing | Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH | ||
Tygon Tubing | Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH | 621 |