Kanin modellen av accelererad ateroskleros: ett metodologiskt perspektiv bäckenartären ballong skada

Summary

Djurmodeller av åderförkalkning är viktiga att förstå mekanismen och utreda nyare metoder för att förhindra plack utveckling eller bristning, en ledande dödsorsak i den industrialiserade världen. Detta protokoll använder en kombination av ballong skada och kolesterol kost för att inducera aterosklerotiska plack i kanin bäckenartären.

Abstract

Akuta koronara syndrom som följd av koronar ocklusion efter blodkärlets utveckling och bristning är den ledande dödsorsaken i den industrialiserade världen. Nya Zeeland White (NZW) kaniner används allmänt som en djurmodell för att studera ateroskleros. De utveckla spontan lesioner när matas med aterogena kost; men kräver detta lång tid av 4-8 månader. För att ytterligare förbättra och påskynda aterogenes, används ofta en kombination av aterogena kost och mekaniska endoteliala skador. Presenterade förfarandet för att inducera aterosklerotiska plack i kaniner använder en ballongkateter för att störa endotelet i den vänstra bäckenartären NZW kaniner utfodras med aterogena diet. Sådana mekaniska skador som orsakas av ballongkateter inducerar en kedja av inflammatoriska reaktioner inleda neointimal lipid ackumulering i en tid beroende mode. Aterosklerotiska plack efter ballong skada Visa neointimal förtjockning med omfattande lipid infiltration, höga glatta muskulatur cellinnehållet och förekomsten av makrofag härrör skumceller. Denna teknik är enkel, reproducerbar och producerar plack av kontrollerade längd inom bäckenartären. Hela förfarandet är avslutat inom 20-30 min. Förfarandet är säker med låg mortalitet och erbjuder också hög framgång att få betydande intimans lesioner. Tillvägagångssättet av ballongkateter inducerad arteriell skada leder till åderförkalkning inom två veckor. Denna modell kan användas för att utreda sjukdom patologi, bilddiagnostik och utvärdera nya terapeutiska strategier.

Introduction

Bristning av sårbara aterosklerotiska plack är en av de ledande dödsorsakerna i industriländerna¹. Forskning under de senaste decennierna har vecklade flera molekylära och cellulära mekanismer som är involverade i plack progression, fortsatte ansträngningar behövs inte bara för att nysta upp den komplexa mekanismen av progression av sjukdomen men också att testa nya terapeutiska tillvägagångssätt. Flera modeller har föreslagits att studera åderförkalkning. Genmanipulation, kolesterol utfodring eller mekanisk skada endotel är standard strategierna delas av mest djurmodeller av åderförkalkning inklusive möss, kaniner och minigrisar. Bland dessa är NZW kaniner känsliga för kolesterol diet medan normala råttor och möss inte avsevärt absorbera kolesterol^2,3,4. Kaniner utvecklar spontant aorta lesioner rik på makrofager med vissa fibrösa komponent när matas med kolesterol kost^5,6. Den långa förberedande tid 4-8 månader att inducera aterosklerotisk plaquesby utfodring kolesterol diet ensam^6,7 är dock en stor nackdel för de flesta experimentella inställningarna. I strävan för att inducera lesioner på relativt kort tid, har en kombination av högt kolesterol kost och ballong skada utvecklats av Baumgarter och Studer⁸. Det övergripande målet för denna teknik är att inducera aterosklerotiska plack består av skumceller (liknar fatty streak hos människor) i hypercholesterolemic kaniner inom 2 veckor. Den nuvarande tekniken beskriver tillvägagångssättet av kärlväggen skada baserat på Baumgarters metod med hjälp av en ballongkateter avancerade in bäckenartären NZW hypercholesterolemic kaniner.

Tillsammans med en kolesterol kost leder skada till följd av ballong inducerad avinstallation endothelialization till åderförkalkning. Ballong skada påskyndar bildandet av aterosklerotiska lesioner och producerar plack enhetlig storlek och fördelning. Intimans förtjockning ökar över en tidsperiod och intimans cell infiltration startar inom några dagar efter skadan. Feta streck med betydande makrofager börjar visas efter 7-10 dagar av ballong skada och representeras som typ II lesion enligt klassificering av American Heart Association. Ballong skada i kanin utförs ofta i aorta för att studera plack sammansättning. Neointimal endotelet uttrycker höga nivåer av intercellulära vidhäftning molekyl. Plack är associerade med mediala dissektion och adventitial förändringar. Aterosklerotiska lesioner består av lipider, prolifererande glatta muskelceller (SMCs), kollagenfibrer och inflammatoriska celler som ackumuleras under regenererad endotelet och är mestadels typ II i naturen. Topologisk fördelningen av kanin plack var liknande som rapporterats i mänskliga artärer ^9,10 i princip, aorta är större i storlek jämfört med bäckenartärerna och skulle producera plack i större längd. Men är den stora fördelen med att använda bäckenartären som platsen för åderförkalkning hos kaniner dess tillgänglighet, dess likhet i muskulös innehåll till mänskliga kranskärl¹¹, enhetlig lesion utveckling¹², hög vävnadsfaktor verksamhet¹³ och konsekvent fartyget dimension jämförbara mänskliga kranskärl som möjliggör utvärdering av kommersiellt tillverkade enheter morfometriska och angiografiska slutpunkter. Invasiva och icke-invasiva metoder har undersökts för att analysera plack i kanin bäckenartärerna i det levande djuret. Tidigare rapporter beskriver användningen av magnetisk resonanstomografi (MRT) med hjälp av en 2,35-tesla MR system ¹⁴ dessutom, intravaskulärt ultraljud (IVUS) eller optisk koherens tomografi (ULT) katetrar kan vara lämpligt tillämpas på bild aterosklerotiska plack i kanin bäckenartärerna. Bäckenartären är tillgänglig för ultraljudsundersökningar när du använder en högupplöst ekografi och aorta kan också undersökas med denna teknik.

Under det senaste decenniet, har denna kanin modell av ballong skada bidragit till att ytterligare förstå mekanismerna bakom plack progression¹⁵och plack regression¹⁶. Dessutom modellen har använts för att studera påverkan av nya terapeutiska medel såsom statiner, standard trombocytaggregationshämmande medel, antioxidant medel^17,18 och drog-eluering stent såsom everolimus eller zotarolimus-eluering stent^19,20 på neointimal förtjockning. Denna modell har också använts för att undersöka intravaskulär avbildning av infrarött fluorescens imaging katetern²¹.

Protocol

detta experimentellt protokoll har godkänts av den kantonala veterinärfrågor, Fribourg och den schweiziska federala veterinär kontor, Schweiz (FR 2015/58). Obs: manliga NZW kaniner som väger mellan 2,8 och 3.2 kg användes. Djuren var inrymt konventionella villkor (12 h ljus och mörka cykel, enligt ad libitum vatten och mat). Innan ballongen denudation, var djur acklimatiserade för 1 vecka under vilken de matades med normala chow kost. Efter 1 veckas acklimatisering, kaniner var bytte…

Representative Results

Ballong skada av bäckenartären utfördes framgångsrikt utan komplikation (figur 1). Den totala operativa tiden varierade mellan 20 och 30 min för skador utförs på endast en bäckenartären och 35 till 45 min för skador på både artärer. Kaninen återhämtade sig inom 1 h efter ballong skada. Alla djur dök upp friska utan betydande viktminskning. Ingen infektion, ödem eller arteriell trombos påträffades. Sårområdet var normalt förutom några mi…

Discussion

Kanin bäckenartären åderförkalkning modellen används ofta i aterosklerosforskning. Med detta protokoll utvecklat kaninerna snabbt mer allvarliga och avancerade plack jämfört med spontana lesioner utvecklade med endast kolesterol diet. Ännu viktigare, djur snabbt återhämta sig från operation.

Aterogenes viktigaste drivfjäder är mekaniska skador som orsakats av den ballongkateter som endotelet och distends fartyget vägg²⁶. Detta förfarande inducerar en omfo…

Materials

New Zealand White rabbits	Charles River laboratories,France	Cre:KBL(NZW)
Cholesterol rich diet	Ssniff spezialdiäten	Ssniff EF K High Fat and Cholesterol
Glass bead sterilizer-Germinator 500	VWR, Leicestershire, UK	101326-488
Fogarty balloon embolectomy catheters, 2 French	Edwards Lifesciences, Switzerland	120602F	For single use only
Luer Lock Syringe	Becton, Dickinson and Company, USA	309628
Thermopad Type 226	Solis, Switzerland AG	397387
Buprenorphine- Temgesic	Reckitt Benckiser AG, Switzerland	7.68042E+12
Isoflurane	Piramal Critical Care, Inc, Bethlehem, PA 18017	2667-46-7
Anaesthesia machine-combi-vet Base Anesthesia System	Rothacher Medical GmbH, Switzerland	CV 30-301-A
Cardell touch veterinary vital signs monitor	Midmark, Ohio, USA	8013-001
Ophthalmic ointment-Humigel	Virbac, France
Animal hair clippers	Aesculap AG, Germany	GT420
Disinfectant-Betadine solution	MundipharmaMedicalCompany, Switzerland	14671-1203
Dumont #7 Forceps	FST Germany	11274-20
Medium and small microscissors	Medline International Switzerland Sàrl	UC4337
Microvascular clamps	FST, Germany	18051-28
Papaverine	ESCA chemicals, Switzerland	RE 356 803
Vein Pick	Harvard Apparatus, Cambridge, UK	72-4169	For single use only
Saline	Laboratorium Dr. G. Bichsel AG, , Switzerland	1330055
Polysorb 5-0 suture	Covidien AG, Switzerland	UL 202	Monofilament
Sulfadoxine and Trimethoprim-Trimethazol	Werner Stricker AG, Switzerland	Swissmedic Nr. 50'361
Antiseptic- Octenisept	Schülke & Mayr AG, Switzerland	GTIN: 4032651214068
Phosphate Buffered Saline	Roth	1058.1
Isobutanol-2-Methylbutane	Sigma-Aldrich, Switzerland	M32631-1L
Optimum Cutting Temperature compound-Tissue-Tek	VWR Chemicals, Belgium	25608-930
Cryostat	Leica, Glattbrugg, Switzerland	Leica CM1860 UV
Glass slide- Superfrost Plus	Thermo Scientific	4951PLUS4
Mayer's Haematoxylin	Sigma-Aldrich, Switzerland	MHS32-1L
Eosin 0.5% aq.	Sigma-Aldrich, Switzerland	HT110232-1L
Oil Red O	Sigma-Aldrich, Switzerland	O0625-25G
α-smooth muscle actin antibody	Abcam, UK.	ab7817
Macrophage Clone RAM11 antibody	DAKO, Switzerland	M063301
Hoechst	Abcam, UK.	ab145596
Goat polyclonal Secondary Antibody (Chromeo 546)	Abcam, UK.	ab60316
Alexa Fluor 488/547	Abcam, UK.
Glycergel Mounting Medium, Aqueous	DAKO, Switzerland	C056330
Hematoxylin for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	H3136-25G
Ferric chloride for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	157740-100G
Iodine for Movat staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	207772-100G
Potassium iodide for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	60400-100G-F
Alcian blue for Movat staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	A5268-10G
Strong Ammonia for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	320145-500ML
Brilliant crocein MOO for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	210757-50G
Acid Fuchsin for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	F8129-50G
Sodium Thiosulfate for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	72049-250G,
Phosphotungstic acid for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	79690-100G
Crocin for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	17304-5G
EUKITT for Movat pentachrome staining	Sigma-Aldrich, Switzerland	03989-100ML