利用合成生物学构建可与可编程材料相互作用的活细胞

摘要

本文介绍了一系列用于开发工程化细胞和功能化表面的实验方案，这些方案能够使合成工程化的大肠杆菌（E. coli）控制和操控可编程材料表面。

摘要

我们开发了一种非生物-生物界面，可使工程化细胞调控功能化表面的材料特性。该系统由两个模块构成：一种经合成改造的大肠杆菌（E. coli）菌株和一种功能化材料界面。本文详细描述了利用分子克隆策略对大肠杆菌（E. coli）菌株进行基因工程改造以实现特定行为的实验方案。该菌株构建完成后，在接触化学诱导剂时可产生较高水平的生物素。此外，我们还详细阐述了构建两种不同功能化表面的实验方案，这两种表面均能响应细胞合成的生物素。综上所述，我们提出了一种构建耦合型非生物-生物系统的方法，该系统可使工程化细胞调控非生命基底上的材料组成与组装过程。

引言

本文报道了一种可编程底物的制备方法，该底物能够响应基因工程细胞系释放的化学信号。¹ 我们通过构建一种生物素-链霉亲和素界面来实现这一目标，该界面可响应由合成改造的Escherichia coli (E. coli)细胞所产生的生物素。此前，可编程表面已被广泛应用于多种领域，包括毒素检测²、即时诊断³以及国防与安全⁴。尽管可编程表面可作为传感器和驱动器发挥重要作用，但若赋予其适应不同环境挑战的能力，则可使其变得更加"智能"。相比之下，即使是大肠杆菌（E. coli）等结构简单的微生物也具有内在的适应性，能够以复杂且常出人意料的方式应对环境挑战。这种适应性使得受其复杂基因网络调控的E. coli群体能够高效地寻找资源⁵、生成高附加值产物⁶，甚至驱动微尺度机器人系统⁷。通过将活细胞的适应性优势与可编程表面相结合，我们能够构建出一种可响应不同环境条件的智能底物。

合成生物学赋予了研究人员编程生物行为的新能力。通过构建含有新型基因调控网络的工程化细胞，研究人员能够设计出表现出多种编程行为....

方案

1. 培养基与培养体系准备

1. 通过将 25 g LB 粉末培养基与 1 L 去离子水（DI 水）混合，并在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟，制备 LB（Lysogeny broth）培养基。
   1. 制备 LB 平板时，在灭菌前向 LB 培养基中加入 15 g 琼脂（1.5%）
   2. 用去离子水配制 1,000 倍浓度的羧苄青霉素（Cb）储备液（50 mg/mL）。
   3. 若制备含有抗生素的 LB 培养基以筛选抗性转化子，需等待灭菌后的 LB 培养基温度降至 60 °C 以下，然后每 1 mL LB 培养基中加入 1 µL 抗生素储备液。
2. 对于 M9 最小培养基（表 1），分别配制以下储备液：5X M9 盐溶液（56.4 g/L）、1 M MgSO₄、1 M CaCl₂、20% 葡萄糖和 2% 无生物素酪蛋白氨基酸。
   1. 在可高压灭菌的瓶中，加入 20 mL 5X M9 盐溶液、200 µL 1 M MgSO₄、10 µL 1 M CaCl₂、2 mL 20% 葡萄糖、1 mL 2% 无生物素酪蛋白氨基酸以及 76.8 mL 去离子水。
   2. 将步骤 1.2.1 中配制的溶液在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。

结果

代表性结果如随附的五幅图所示。首先，我们以图形方式展示克隆过程（图1），以便读者能够直观地了解构建合成改造的大肠杆菌（E. coli）菌株的关键步骤。为了表征细胞的群体动态，我们提供了通过测量菌群在600 nm处的光密度（OD₆₀₀）所生成的生长曲线（图2）。接着，我们展示如何通过使用mCherry作为bioB的替代指标来验证调控基因网络（图3），从而能够通过光学方法测量细胞在IPTG诱导后所产生的bioB的相对含量。然后，我们展示了间接控制和直接控制功能化表面的响应数据。这些数据图（图4）是通过使用已知浓度的游离生物素溶液来表征功能化表面的响应特性而获得的。最后，我们展示了特征性数据，说明工程化细胞如何被诱导产生生物素（图5），从而对功能化表面进行修饰。

讨论

我们提出了一种将工程化活细胞与功能化材料表面相连接的新策略。该策略通过构建一种能够在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下合成高水平生物素的细胞系来实现。所产生的高水平生物素可用于修饰功能化表面。文中详细描述了如何构建大肠杆菌（E. coli）细胞系，以及如何制备两种不同的功能化表面。

在构建工程细胞系的整个过程中，存在多个关键步骤。为避免后续问题，建议对工程细胞株进行生长曲线（图2）和荧光响应（图3）的表征。若实验过程中出现问题，可在适当步骤中采用其他分子克隆策略，例如PCR扩增和Gibson组装¹⁴作为替代。为优化工程细胞系的生物素产量，必须确保向细胞提供足量的DTB。在我们的研究中发现，当细胞经IPTG诱导时，添加200 ng/mL DTB可显著且统计学上显著地提高生物素的产量。此外，BSA-Biotin、SA-HRP和Biotin-HRP的成功偶联对于有效实施和监测间接与直接对照方案至关重要。操作时应注意避免不必要的光照，并将偶联物在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LB肉汤，Miller	费舍尔科技	12-795-027
琼脂	费舍尔科技	BP9744500
羧苄青霉素	费舍尔科技	BP26481
M9最小盐溶液，5倍浓度	西格玛-奥德里奇	M6030
酪蛋白氨基酸	费舍尔科技	BP1424-100
无水硫酸镁	费舍尔科技	M65-500
二水合氯化钙	费舍尔科技	C79-500
无水右旋糖（D-葡萄糖）	费舍尔科技	D16-1
NEB Turbo细胞系	新英格兰生物实验室	C2984l
寡核苷酸引物	赛默飞世尔科技	N/A	25N合成，DSL纯化
Q5高保真聚合酶	新英格兰生物实验室	M0491S
Q5反应缓冲液	新英格兰生物实验室	B9027S
dNTP溶液混合物	新英格兰生物实验室	N0447S
琼脂糖	Bioexpress	E-3120-125
溴化乙锭，1%	费舍尔科技	BP1302-10
凝胶回收试剂盒	Epoch Biolabs	2260250
GenCatch质粒DNA小量提取试剂盒	Epoch Biolabs	2160250
AatII	新英格兰生物实验室	R0117S
SacII	新英格兰生物实验室	R0157S
HindIII-HF	新英格兰生物实验室	R3104S
EcoRI-HF	新英格兰生物实验室	R3101S
Cutsmart缓冲液	新英格兰生物实验室	B7204S
T4 DNA连接酶	新英格兰生物实验室	M0202S
T4 DNA连接酶反应缓冲液	新英格兰生物实验室	B0202S
ColiRolle玻璃涂布珠	默克密理博	7101-3
甘油	费舍尔科技	BP229-1
异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）	费舍尔科技	BP1755-10
NHS-脱硫生物素（DTB）	赛默飞世尔科技	16129
琥珀酰亚胺基反式-4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯（SMCC）	赛默飞世尔科技	S1534
二甲基亚砜（DMSO）	费舍尔科技	BP231-100
琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯（SPDP）	赛默飞世尔科技	S1531
NHS-LC-LC-生物素	赛默飞世尔科技	21343
辣根过氧化物酶（HRP）	赛默飞世尔科技	31490
磷酸盐缓冲液（PBS），10倍溶液	费舍尔科技	BP399500
链霉亲和素（SA）	赛默飞世尔科技	21145
牛血清白蛋白（BSA）	费舍尔科技	BP1600-100
二硫苏糖醇（DTT）	费舍尔科技	BP172-5
乙二胺四乙酸（EDTA）	费舍尔科技	S311-500
吐温80	费舍尔科技	T164-500
过氧化氢	费舍尔科技	H325-4
3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）	费舍尔科技	AC229280050
Vivaspin 500离心浓缩器	Viva Products	VS0192
无水乙酸钠	费舍尔科技	BP333-500
96孔聚苯乙烯板	赛默飞世尔科技	266120