Det här protokollet beskriver användningen av sumpen kompresser och slam analys av zebrafisk system, vilket leder till ökad upptäckt jämfört enda användning av vaktposter att upptäcka patogener såsom Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. och Pseudocapillaria tomentosa. Ett system för att övervaka P. tomentosa ägg i karantän föreslås också.
Hälsa system utvecklas och används i zebrafiskar forskningsanläggningar eftersom patogener av Danio rerio såsom Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. och Pseudocapillaria tomentosa har potential att försämra djurens välbefinnande och forskning. Fisken är vanligtvis analyseras efter slakt att upptäcka mikrober. Användningen av GMES-satelliterna är föreslagna sätt att förbättra känsligheten för övervakning och att minska antalet djur att prova. Inställningen av en pre-filtrering sentinel tank ur ett recirkulerande system beskrivs. Tekniken är utvecklad att förhindra vattenförorening och att representera fiskpopulationen genom ett noggrant urval av ålder, kön och stammar. För att kunna använda det minsta antalet djur, är tekniker att skärmen miljön också detaljerade. Polymerase Chain Reaction (PCR) på ytan sump kompresser används för att avsevärt förbättra upptäckten av vissa utbrett och patogena mykobakteriella arter såsom Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium haemophilumoch Mycobacterium chelonae. En annan miljömässig metod består av behandlingen av slammet på botten av en uppsamlingstank eller sumpen att leta efter P. tomentosa ägg. Detta är en billig och snabb teknik som kan tillämpas i karantän där en avel enhet är nedsänkt i uppsamlingstank importerade djur. Slutligen, PCR tillämpas slam provet och A. hydrophila upptäcks vid sumpens botten och ytan. Generellt, dessa miljögranskning tekniker tillämpas på dessa specifika patogener har lett till ökad känslighet jämfört med testning av pre-filtrering vaktposter.
För att skydda forskning och djurskydd1,2, övervakas förekomsten av patogener inom djur faciliteter. När det gäller zebrafiskar,3,4,5,6,7,8,9,10,11 för hälsoövervakning ofta förlitar sig på djur analyseras efter slakt av histopatologi, bakteriologi kultur eller molekylära metoder. Testning endast kolonin djur är inte metoden som rekommenderas på grund av antalet fisk och relaterade kostnader som skulle krävas för att upptäcka patogener av låg prevalens. Därför är den rekommenderade metoden att avslöja en liten grupp av djur till en högre belastning av föroreningar. Dessa fiskar kallas pre-filtrering vaktposter. Denna exponering varar i månader och det innebär en ökning av den animaliska CARERs arbetsbelastning och/eller vissa specialbyggda teknisk lösning. En annan utmaning är screening av importerade raderna i karantän där de fertila djur skall hållas vid liv och detta är inte förenligt med rutinmässiga analyser på slaktkroppar.
Här beskriver vi några metoder för att upptäcka vissa zebrafiskar patogener (A. hydrophila, Mycobacterium spp. och P. tomentosa) genom screening systemets akvatiska miljön. Syftet är att minska antalet fiskar som används för övervakning av hälsotillstånd och att optimera omsättning, kostnad och känsligheten för upptäckt. Sådana metoder är ett alternativ till användning av djur och vissa tekniker kan användas för screening import i karantän. Till exempel Mocho9 kunde identifiera fler patogena mykobakteriella arter genom att utföra PCR på sumpen kompresser snarare än på zebrafisk (inklusive sentinels), och detta erhölls med färre prover. I det samma studie, P. tomentosa ägg upptäcktes med mer känslighet av screening tank slammet med flotation och mikroskopi snarare än testning fisk av PCR och histopatologi.
Tabell 1 sammanfattar de olika egenskaperna hos sentinel program3,4,5,6,7,8,9,10 används av ett antal zebrafiskar faciliteter. Efter filtrering vaktposter får vatten på samma sätt som någon koloni fisk medan pre-filtrering vaktposter få vatten när det har cirkulerat genom kolonin fisketankar först. Till exempel kan pre-filtrering vaktposter ställas in på recirkulerande system genom att kontinuerligt få sump vatten. Detta kan inte vara ett alternativ när det finns många oberoende system i ett rum. I det här fallet kan en tank av pre-filtrering vaktposter användas till skärmen hela rummet. Sentinels är en statisk tank, ur recirkulerande system, och deras vatten byts regelbundet, använder bara pre-filtrering vatten dvssump vatten från alla system i rummet. Denna teknik beskrivs nedan som en originalplan för jämförelse med effekten av miljögranskning. Den föreslagna strukturen är utformad för att styra vatten kvalitetsfrågor som en minskning av pH eller ett kväve föroreningar.
Begreppet den bakteriella miljögranskning bygger på hypotesen att bakterier kan påvisas i biofilm som hittade på sumpen väggen vid vattenytan eller i slammet på botten av en tank. Sumpen verkar en idealisk provtagningspunkt i en recirkulerande vattenbruk-systemet eftersom den samlar in avfall (vatten, avföring, foder och annat organiskt material) från alla tankar pre-filtrering. Ytan av sumpen är ofta lätt att nå, de badda är snabb och det kan utföras aseptiskt för att undvika korskontaminering av provet (från handskar till exempel). Begreppet används för att identifiera vanliga patogena Mycobacterium spp. i zebrafiskar system9,12. Tekniken beskrivs nedan och redovisar vi också upptäckt av A. hydrophila i zebrafiskar sumpen ytbehandlar kompresser och slam.
Miljömässiga screening för parasit ägg bygger på detektion av Murray et al. 13 och flotation tekniken används rutinmässigt för parasitologi och mikroskopiska screening av parasiten ägg i feces14. Mocho9 föreslagit ett alternativ till provtagning processen och visade att tekniken kunde användas för att upptäcka andra arter av fisk biotopen. Infekterade D. rerio passera P. tomentosa ägg med deras avföring och parasit äggen kvar på botten av tanken, i slammet. De kan samlas där på grund av deras densitet större än vatten. Tätheten av äggen används för att behandla miljömässiga provet också. En första flotation med centrifugering avskiljer vatten och ljus skräp från tyngre fråga. En andra centrifugering bygger på mättad sockerlösning (med en densitet större än tätheten av P. tomentosa ägg) för att möjliggöra parasit äggen att dyka upp på ytan av röret.
Screening för bakterier i biofilmen och P. tomentosa från botten av tanken kan kombineras genom att utföra PCR för alla dessa patogener på slam prov sedimenten erhålls efter den första centrifugeringen. Detta optimerar provtagningstiden. Metoden beskrivs nedan. Vi föreslår också att använda dessa tekniker i en karantän sammanhang. Skärm importerade vuxen zebrafiskar som behöver hållas vid liv, sätts en avel enhet till karantän tank. Efter en vecka, avföring och annat avfall i avel enheten hämtas och säkerhetskontrolleras med mikroskopi eller PCR. Tekniken beskrivs nedan och vissa P. tomentosa ägg upptäcktes av mikroskopi i detta sammanhang.
Begränsningar av tekniker, kritiska moment, och felsökning:
Ålder, kön, stam och längden på exponering av sentinels är inte standardiserade. Detta visas i tabell 1. Det finns mycket lite screening av fisk under 6 månaders ålder eller äldre fisk. Det kan finnas vissa patogener som påverkar unga fisken som det finns vissa patogener som är vanligare hos äldre befolkning10,18,19,20. Likaså anses inte kön i valet av vissa sentinel grupper trots vissa rapport att det finns en könsfördomar för vissa patogener21. Den föreslagna tekniken försöker lösa problemen, även om valet av stammen kunde göras enligt en specifik patogen att övervaka. Till exempel TU kunde hjälpa med påvisande av Mycobacterium spp.12,22, men det finns en risk att sentinels skulle då fungera som en reservoar eller display kliniska tecken. Angående längden på exponering ökar metoden med zebrafiskar International Resource Center10 chanserna att upptäcka patogener som kan missas med en otillräcklig kontaminering period. Behovet av långvarig exponering innebär att vaktposter inte är lätt tillgängliga. Tillägg av miljöprover tillåter viss flexibilitet och multiplikation av screening händelser. Till exempel kan provtagning ske varannan månad med 4 månaders intervall mellan varje screeningmetod. Detta kan minska den tid som förflutit innan nyinförda patogener upptäcks.
Miljögranskning tekniker är beroende av patogener i miljön. Patogener är skjul av fisken och därför utspätt i systemets vatten. Var inte att undersöka möjligheten att fånga patogenerna av vattenfiltrering23 . De metoder som vi beskriver är bara effektiva om patogener ges tillräckligt med tid att föröka sig i fisk och biofilm att nå ett tröskelvärde för kontaminering som möjliggör identifiering. Denna begränsning av tekniker minimeras genom ett kritiskt urval av provtagningspunkterna: slammet i tanken samplas snarare än sump slammet och vattnet och biofilm provtas på ytan av sumpen i stället för i en tank eller efter filtrering. Alla prover från samma system finns dock osannolikt att ge samma resultat. Positiva resultat för P. tomentosa kan bekräftas med hjälp av en annan analys (histopatologi, PCR eller slam analys). Mykobakteriella PCR-positiva resultat kan bekräftas av kultur eller ett annat diagnostiskt laboratorium. Men, när du upprättar en hälsostatus, ytterligare prover rekommenderas att bekräfta negativa resultat från någon miljösållning teknik.
Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga/alternativa metoder:
Mycobacterium spp. är vanliga i miljön och deras närvaro i sumpen förutsäga inte deras patogenicitet12. Mocho9 visade att övervakning dödligheten är nyckeln att kartlägga utvecklingen av hälsofrågor. Användningen av animaliskt prover fortfarande viktigt att veterinärmedicinska undersökningar. Hälsoövervakning innebär alla förekommande patogener i en anläggning och detta kan inte uppnås med enbart användning av miljögranskning tekniker. Dock kan en brist på känslighet av diagnos verktyg fördröja eller förhindra en korrekt beskrivning av hälsoläget. Medan användningen av vaktposter minskar antalet fiskar som krävs för att upptäcka en förhärskande mikrob i befolkningen, avsaknaden av känslighet lägger till vikt genom en kombination av metoder, inklusive miljögranskning5,23. Verkligen definieras specifik patogen fri status brukar som avsaknad av en art i anläggningen så att miljön och djurs prover måste testa negativa24,25.
Sumpen provstickan resultaten att identifiera Mycobacterium spp. visar att förlita sig på fisk prover kan leda till ett falskt negativa hälsotillstånd. De 6 testa mykobakteriella arterna beskrivs som patogena eller potentiella patogena zebrafiskar15 och några vill inte elimineras genom ägg ytdesinfektion med klor26 som rutinmässigt utförs i karantän. Därför, den falska negationen kanske vissa konsekvenser för medarbetare som importerar rader. Till exempel M. fortuitum missades av PCR på fisk prov men mer än hälften av sumpen pinnen PCR upptäckt den. Med tanke på att dessa mykobakterier är mer resistenta mot klor än andra och deras förmåga att växa i vattensystem27, är det en risk för icke-kontaminerade importerande anläggningen. Import av linjer måste chefer kunna, lita och jämföra exporterande anläggningen med deras hälsa rapporter. ICLAS prestanda utvärdering Program28 är nyckeln till det processen i gnagare. RESAMA nätverket rapporterar upptäckt av M. gordonae och M. mucogenicum i franska D. rerio11. Dessa mykobakterier föreslås inte i panelerna av kommersiella laboratorier som vi använder. Det skulle vara nyttigt att förlänga programmet ICLAS och att harmonisera de diagnostiska analyserna samt listan över patogena arterna29.
A. hydrophila är också en patogen som har potential att införas när du importerar djur, även om dess känslighet för klor30 gör dess eliminering mer troligt under rutinmässig ägg ytdesinfektion. Den sump, pinnen och slam resultat visar att miljögranskning kan användas för att upptäcka denna patogen. Andra bakterier som Mycobacterium spp. har upptäckts i slammet av PCR-23. Denna typ av prov är särskilt relevant eftersom det tillåter skjul patogener. En annan ny ansökan är exempelvis slam analysen till skärmen importerad fisk i karantän för P. tomentosa. Parasiten är ett hot mot djurets hälsa13 och neoplasi modeller16. Dessutom är klor koncentrationer används i rutinmässiga zebrafiskar ägg ytdesinfektion inte effektiv31. Förmågan att skärmen de importerade djuren med en veckas omsättning och utan någon fisk dödshjälp förefaller därför mycket attraktiv. Denna teknik kan påverka karantän och biosäkerhet reglerna genom att låta en triage av importen. En beslutsprocess är sedan utformade enligt de förhärskande patogenerna i exporterande anläggningen, de upptäckta patogenerna i proverna från importerade fisken och risken för att äventyra hälsostatusen hos den importerande anläggning10.
Framtida tillämpningar eller riktningar efter bemästra dessa tekniker:
Även om rutinmässiga karantän behandling är det valda alternativet, kan effekten av sådan medicinering32,33,34,35,36 bedömas med avel enhet slam analysen. Mer allmänt miljögranskning kunde användas för att testa föreningar mot bakterier och parasiter utrotning, bland annat i fisk biotopen. En annan nisch tillämpning av miljömässiga screening är att övervaka patogen befolkningen i live feed37,38. Den huvudsakliga tillämpningen av dessa tekniker är dock som ett värdefullt tillskott till diagnos verktygslådan för hälsoövervakning i zebrafiskar faciliteter. Tack vare en mer exakt, kostnad och tid effektiv definition av hälsostatus, sump kompresser och slam analys är komplement till sentinelövervakning och den rutinmässiga karantän praxisen. Framtiden för dessa tekniker är faktiskt att vara en rutinmässig del av någon vattenlevande laboratorierapport hälsa.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka BRF simsport laget av Francis Crick Institute for deras teknisk hjälp och kritiska input. Detta arbete stöds av Francis Crick Institute som mottar dess basfinansiering från Cancer Research UK (FC001999), brittiska Medicinska forskningsrådet (FC001999) och Wellcome Trust (FC001999).
Aqua-Sed 250 mL | Vetark | 2-phenoxyethanol | |
Tubed Sterile Dryswab Tip | mwe | MW100 | Sump surface |
BD Plastipak Disposable Syringe 50mL Eccentric | Becton Dickinson |
300866 | They are actually graduated to 60 ml |
Centrifuge tube 15 mL Corning | Corning | 430766 | |
Centaur 2 benchtop centrifuge with 4 x 200 mL Swing–Out Rotor (unsealed) | Sanyo | MSB020.CX1.5 | |
Cover Glass 22 mm x22 mm | Menzel-Glaser | MNJ-350-020H | |
Plain Swab Sterile Plastic Applicator Rayon Tipped White Cap | Sterilin Ltd Thermo Fisher Scientific | F155CA | Swab sediment from sludge |
50 mL Self-Standing Centrifuge Tube CentriStar Cap | Corning | 430921 | |
In-Tank Spawning Tray Set | MBK Installations Ltd |