Utvärdering av intracellulära läge av reaktiva syreradikaler i Solea Senegalensis spermier
Summary
Det här protokollet beskriver en detaljerad metod för att upptäcka H2O2 lokalisering inom Solea senegalensis spermier med en känslig fluorokrom DCFH-DA för ROS, en levande mitokondrier fläcken för mitokondrier och DAPI för kärnor visualisering, respektive. Protokollet är avsett att utföras inom 2 h med antingen färska eller tinade spermier.
Abstract
Oxidativ stress är en av de viktigaste faktorerna för minskar spermiernas kvalitet. Utveckla effektiva protokoll för att upptäcka reaktiva syreradikaler (ROS) i spermier är av stor betydelse i alla arter, men dessa metoder är används sällan och ännu mindre i benfisk. Frysförvaring är en användbar teknik i vattenbruk för olika ändamål, inklusive gen bank och garanterad spermier tillgänglighet under hela året. Frysning/upptining förfaranden kan orsaka ROS produktion och skada spermacellerna. Med tanke på den potentiella skada som kan ett överskott av ROS produktion orsaka i spermatozoa beroende på deras localization, här en detaljerad metod att upptäcka H2O2 och utvärdera dess intracellulära lokalisering av konfokalmikroskopi tillhandahålls. För detta ändamål används en kombination av 3 fluorokromer (2′, 7-Dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA), en levande mitokondrier fläcken och 4′, 6-diamidin-2-fenylindol dihydroklorid (DAPI)) att utvärdera samtidig localizationen av H2O2 med spermier kärnor eller mitokondrier i Solea senegalesis spermier prover.
Introduction
Reaktivt syre arter produktionen har kopplats till spermiekvalitet nyligen1. Även om ROS produktion i mitokondrier kan anses vara en normal fysiologisk process, är oxidativ stress av ett överskott av ROS produktion en tydlig orsak till skador i spermier på olika nivåer. I människor associeras oxidativ stress med manlig infertilitet, förändra motilitet och en förmåga att genomgå capacitation2; hos däggdjur, har förändring av DNA integritet i frysta spermier prover varit också relaterade till syntesen av H2O23.
Frysförvaring är en vanlig teknik för gen banking i vattenbruk. Denna teknik är särskilt viktigt för arter med reproduktiva problem såsom Solea senegalensis. Denna värdefulla arter på marknaden visar reproduktiv dysfunktion i individer födda i fångenskap på grund av uppvaktning. Detta faktum gör spermier frysförvaring nödvändigt att ha spermier tillgänglighet för konstgjord befruktning. Frysförvaring kan dock en källa till oxidativ stress som kan vara skadliga för spermier4 som studier har rapporterat en gynnsam effekt av antioxidant tillskott. ROS hämning genom mitokondrie-riktade antioxidant var enligt uppgift fördelaktigt för Frysförvaring av spermier i gula havskatt5.
Nivåerna av ROS i spermier prover är därför viktigt att veta, särskilt efter frysförvaring6,7 eftersom dessa molekyler har erkänts som en nackdel för spermier överlevnad och fertilitet8. Dessutom kan det vara avgörande att härleda potentiella skadenivå studerar fördelningen av ROS i cellen. Som ett exempel, låga nivåer av ROS i mitokondrierna kunde antas normalt och kompatibel med spermier-funktionen, men höga nivåer av ROS inom kärnan kan vara indikatorer på spermier DNA-skador. H2O2 är en av de mest relevanta ROS som kunde frigöras från mitokondrierna och penetrera kärnan eftersom det är en liten och kostnad-mindre molekyl9. Dichlorofluorescein diacetat (DCFH-DA) kan specifikt avslöja intracellulära peroxid avger grön fluorescens. I den här artikeln presenteras ett detaljerat protokoll för att upptäcka H2O2 intracellulära lokalisering i Solea senegalensis spermier med konfokalmikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det är väl känt att mitokondrierna är viktiga organeller för spermiernas rörlighet och funktion. Dessa organeller är samtidigt direkt involverade i ROS produktion. Intressant, behövs kontrollerade nivåer av ROS för korrekt spermier funktion1. Positiva relationer mellan fertilitet och oxidativ stress har visats i däggdjur11 men alltför höga halter påverka spermier kvalitet12. En avgörande faktor som kan vara avgörande för en positiv e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Detta arbete fick ekonomiskt stöd av AGL201568330-C2-1-R project (MINECO/FEDER). David G. Valcarce finansierades av Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) och Fondo Social Europeo. Författarna erkänner Dr Ana Riaza och Stolt Sea Farm S.A., Dr Paulino de Paz, Dr Ignacio Martínez Montero och José Ramón Guiérrez. Vi tackar också Paula Fernández Colado för videography.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
- Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
- Morielli, T., O’Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa. Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. , (2016).
- Zhu, Z., et al. Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action. PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).
- Fang, L., et al. Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish. Cryobiology. 69 (3), (2014).
- Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).
- Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm. Theriogenology. 73 (3), (2010).
- Guthrie, H. D., Welch, G. R. Effects of reactive oxygen species on sperm function. Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).
- Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. Reactive oxygen species and sperm function–in sickness and in health. J Androl. 33 (6), (2012).
- Valcarce, D. G., Robles, V. Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa. Reproduction. 152 (5), (2016).
- Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress. Biol Reprod. 91 (3), (2014).
- Cabrita, E., et al. Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis. Aquaculture. 432, 389-401 (2014).
