כאן, אנו מתארים assay כרומטוגרפי בשילוב עם ההפרדה ניידות יון של פפטיד מבשרי ואחריו ברזולוציה גבוהה (~ 30,000) MS-הזיהוי של פפטיד קטעים על כימות של פפטיד מחודדים הסטנדרטים של נוגדן חד שבטי תקציר.
הניתוח של זיהומים חלבון ברמה נמוכה (1-100 ppm) (למשל, התא המארח חלבונים (HCPs)) חברת חלבון הוא assay מאתגר הדורשים רגישות גבוהה ויכולת טווח דינמי רחב. מבחני כימות מסה ספקטרומטר מבוססי חלבונים כרוך בדרך כלל לעיכול חלבון ואחריו התגובה ניטור/ריבוי סלקטיבי התגובה ניטור (רלוקטנציה ממותג/MRM) כימות של פפטידים באמצעות זוגיים (Rs ~ 1000) ברזולוציה נמוכה פאול ספקטרומטר מסה. אחת המגבלות של גישה זו היא התופעה להפרעה נצפו כאשר פפטיד עניין יש את קודמן “אותו” ואת קטע המוני (מבחינת ערכים מ/z) כמו פפטידים eluting שיתוף אחרים נוכח המדגם (בתוך חלון 1-Da). כדי למנוע תופעה זו, אנו מציעים גישה spectrometric המוני חלופיים, וזמינותו MRM סלקטיביות גבוהה (HS) שמשלב ההפרדה ניידות יון של פפטיד סימנים מקדימים ברזולוציה גבוהה (Rs ~ 30,000) MS זיהוי של פפטיד קטעים. חרשנו את היכולות של גישה זו לכמת סטנדרטים נמוכים-שפע פפטיד עלה בתקציר נוגדנים חד שבטיים (mAb) ולא הוכיח כי יש את הרגישות ואת טווח דינמי (לפחות 3 סדרי גודל) שהושגה בדרך כלל HCP ניתוח. כל תקני פפטיד 6 זוהו בריכוזים המתחילים 0.1 nM (טעון על עמודה כרומטוגרפי של מזהה 2.1 מ מ 1 femtomole) בנוכחות פפטיד גבוהה-שפע רקע (2 µg של mAb תקציר טעון בעמודה). כאשר בוחנים את MW של ארנב phosphorylase (97.2 kDa), שממנו נשאבו של פפטידים מחודדים, LOQ של assay זו הוא נמוך יותר מאשר 50 ppm. סטיות תקן יחסית (RSD) של שיא אזורים (n = 4 משכפל) היו פחות מ 15% על-פני הטווח ריכוז כל חקירה (0.1-100 ננומטר או ppm 1-1, 000) במחקר זה.
כימות של מולקולות גדולות (חלבונים) בהגדרות תעשייתי מבוסס כרגע על immunoassays (למשל, ELISAs), בעיקר בזכות מספר יתרונות: רגישות, תפוקה גבוהה, נוחות השימוש ועלות נמוכה עבור דגימה. בעת החלת לנתח חלבון נמוכה-שפע הטומאה (1-100 ppm של התא המארח חלבונים (HCPs)) נוכח חלבון הרפוי, מבחני ביולוגיים אלה מספקים בדרך כלל ריכוז HCP מוחלט (בדרך כלל לידי ביטוי ppm או ng HCP/mg mAb), אבל הם אין אפשרות לזהות ומדידת מזהמים HCP בודדים. לאחרונה פותחו מספר מבחני מבוססי MS כהשלמה ELISAs או לספק מידע ELISAs להיכשל מציעים1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. בגלל המורכבות של הדגימה ואת הדרישה לזהות פפטידים HCP על פני טווח דינמי רחב בריכוז (לפחות 3 סדרי גודל), יש רב-ממדי שיטות כרומטוגרפיות נכנס נרחב מדגם fractionation באופן מסורתי כבר מועסקים כדי לסייע בזיהוי נמוכה-שפע HCPs1,2,3,4,5,6,7.
טבעי צעד בעקבות זיהוי HCP והוא באימות HCP מעקב (מעקב) על פני קבוצות מרובות של תכשירי ביו. במצב זה, הוצעו שיטות LC/MS יחיד-מימד כדי לשפר את הדגימה תפוקה8,9. עם זאת, הדיוק ואת טווח דינמי של HCP מדידות עשוי להיות מושפע ב assay LC/MS 1 י על ידי נוכחות המכריע של פפטידים ביולוגיות. לעומת פרידה רב-ממדי, הפוטנציאל של האות הפרעה19,20,21,22 גדל בפרידה כרומטוגרפי יחיד-מימד כי ההסתברות מבשרי פפטיד יותר להיות שותף eluting הוא גדל. שילוב של אמצעים אורתוגונלית המפריד בין פפטיד מבשרי ללא הארכת הזמן ההפרדה כרומטוגרפי בבירור יהיה יתרון. מטיילים גל-יון-ניידות (TWIM)-10 יש את היכולת לפתור גדוש ספקטרה MS באלפיות שניה. כ-500 ניידות הפרדות יכול להתבצע במהלך • תנאי של פפטיד יחיד, בהנחה ברוחב מלא כרומטוגרפי שיא של 10 s ובהתחשב בעובדה זמן הריצה של ההפרדה IM על הכלי ניידות יון היא 20 ms.
מבחני spectrometric מסה על כימות חלבון פותחו בהצלחה במהלך העשור שימוש מקובל היטב נבחר התגובה (מספר) פיקוח על הגישה (שיטת רלוקטנציה ממותג/MRM) מיושמת טנדם ספקטרומטרים המונים11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 22, ,23. אחת המגבלות של assay המוני spectrometric ברזולוציה נמוכה זו היא הפרעה תופעה19,20,21,22 נצפו פפטיד של עניין יש את “אותו” קודמן פרגמנט פפטידים משותפת eluting מסה אחרים להציג את המדגם (בתוך חלון 1-Da). קיימות שתי דרכים כדי לשפר את הדיוק של השיטות רלוקטנציה ממותג/MRM: אפשרות אחת כרוכה שלב הפרדה נוספת ברמת קודמן כדי להסיר יונים קודמן מפריעות, ואילו האפשרות האחרת היא להגדיל את הרזולוציה MS של זיהוי קודמן/פרגמנט כדי הימנע אותות MS חופפים. מצב רכישה (HS) MRM סלקטיביות גבוהה שתואר כאן לוקח את היתרונות של שתי גישות אלה על ידי צימוד ההפרדה ניידות יון של סימנים מקדימים פפטיד עם ברזולוציה גבוהה (Rs ~ 30,000) MS זיהוי של פפטיד קטעים. וזמינותו המתוארים כאן מכסה לפחות שלושה סדרי גודל, שהוא בדרך כלל את הטווח הדינמי שנצפתה רלוקטנציה ממותג/MRM פרוטאומיקס ניסויים17,18,24.
השירות של HS-MRM וזמינותו על כימות HCP הודגם על-ידי ניטור על ליניאריות של אותות המיוצר על ידי סטנדרטים פפטיד 6 עלה בריכוזים שונים (טווח 0.1 – ל 100 ננומטר) בתקציר נוגדנים חד שבטיים.
ברזולוציה גבוהה (ר’ > 20,000) ספקטרומטר מסה משמש באופן שגרתי אפיון מבניים של חלבונים טיפולית על מגוון פלטפורמות כלי נגינה. לעומת זאת, כימות חלבון מבוססי MS מבוצעת בדרך כלל על ידי רלוקטנציה ממותג/MRM על ברזולוציה נמוכה (Rs ~ 1000) טנדם פאול המוני ספקטרומטרים באמצעות פפטידים החתימה שנוצר על ידי המחשוף אנזימטי של החלבונים11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. כפי הפרדות כרומטוגרפי יחיד-מימד לא לפתרון מלא תערובות פפטיד מורכב המיוצר על ידי עיכול אנזימטי, • שותף תנאי פפטיד הוא תופעה שכיחה, גם במקרה של תקציר יחיד-חלבון. על מעכל חלבון מורכב מאוד (למשל, עבור כימות של ppms 1-100 של HCPs בנוכחות רקע עשיר פפטיד המיוצר על ידי החלבון טיפולית), רגישות, הדיוק, או ליניאריות של רלוקטנציה ממותג/MRM assay יכול להיות מושפע . אני רציני.
מבחני רלוקטנציה ממותג/MRM יש סלקטיביות unidimensional, להסתמך רק על שילוב “ייחודי” של ההמונים קודמן/פרגמנט. מסיבה זו, מבחני אלה נכשלים במצבים כאשר ברקע פפטיד משתנה באופן בלתי צפוי (למשל, עבור דגימות ביולוגיות המתקבל תהליכי טיהור שונים). כדי להתגבר על מגבלות אלה, אנו מציעים כאן סלקטיביות גבוהה (HS) MRM assay מיושם על יון מאופשר ניידות פאול ברזולוציה גבוהה זמן-של-טיסה (QTOF) היברידית ספקטרומטר מסה (עבור כלי הדיאגרמה, ראה איור 6).
הכלי מפריד את סימנים מקדימים של פפטיד עניין בין מבשרי פפטיד (מפריעות) eluting שיתוף אחרים בתא ניידות יון, מבודד מעטפת מלאה איזוטרופי למבשר ב פאול, קטעים זה עם CE קבוע ב- תא התנגשות. האות המיוצר על ידי שבר פפטיד הנפוץ ביותר שלה היא משופרת נוספת על ידי התאמת התדר דוחס (שיפור היעד), אשר באופן סלקטיבי דוחף אזורים המוני עניין לתוך הצינור טיסה, יותר מאשר כל יונים, כמו עם סריקה מלאה. פפטיד כימות מתבצעת באמצעות את האותות גבוהה-MS-רזולוציה (Rs ~ 30,000) המיוצר על ידי יון קטע זה. בהשוואה של מבחני רלוקטנציה ממותג/MRM, וזמינותו HS-MRM מציע שתי רמות נוספות של סלקטיביות: אחד מסופק על ידי ההפרדה ניידות קודמן ברמת יון, בעוד השני מוצע על ידי הרזולוציה המוני מוגברת במנתח TOF. התוצאות על-ידי השיפורים סלקטיביות גלויים ב- chromatograms HS-MRM המוצגת באיור 7, אשר הינם ללא הפרעות על-פני שלושה סדרי גודל.
בניגוד מבחני רלוקטנציה ממותג/MRM, קיימים מספר פרמטרים שניתן לכוונן כדי למטב את מבחני HS-MRM: החלון RT סביב למבשר פפטיד (בדרך כלל מוגדר ב- 0.2 דקה), החלון בידוד פאול (4 Da), חלון הזמן הסחף המקיפים קודמן (± FWHM השיא קודמן מ mobilogram התואמת יון), את הרזולוציה MS של יונים פרגמנט (20,000-40,000). מבחני HS-MRM רגישים מאוד: הסכום שזוהו הנמוך ביותר עבור כל פפטידים PHO הוא 1 femtomole על עמודות (או 0.1 nM מבחינת ריכוז פפטיד). כאשר בוחנים MW פפטידי (ראה טבלה 1 MWs מדויק), הסכום זוהה על עמודות הוא גודל עמוד 1-2, בעוד העמודה היא עמוסה סכום גבוה משמעותית (2 µg) של פפטידים רקע מן התקציר mAb.
על ידי בוחנים את המשקל המולקולרי של חלבון PHO באורך מלא (97.2 kDa) שממנו נשאבו של פפטידים מחודדים, וזמינותו הוא מסוגל לזהות 50 ppm של טומאה חלבון בנוכחות גבוהה-שפע רקע יונים. מהגבולות התחתונים של זיהוי (5-10 ppm) השגה עבור משקל מולקולרי נמוך יותר HCPs (10-20 kDa). וזמינותו מכסה שלושה סדרי גודל (כפי שמוצג את עקומות כיול של איור 8), מה שאומר כי זה יכול למדוד HCPs בטווח 1-1, 000 דפים לדקה. כמו כן, הפארמצבטית של מבחני HS-MRM, מאויר בטבלה 3, תואמת היטב הפארמצבטית של מבחני רלוקטנציה ממותג/MRM מולקולה קטנה, עם שיא אזור RSDs יותר מ- 15%.
אנחנו בחנו את היכולות של assay הרומן על כימות של פפטיד מחודדים הסטנדרטים של נוגדנים חד-שבטיים (mAb) תקציר והפגינו את הרגישות ואת השירות כדי לכסות את טווח דינמי רחב (לפחות שלושה סדרי גודל) בדרך כלל המערכת נתקלה בניתוח HCP. כל תקני פפטיד 6 זוהו בריכוזים המתחילים 0.1 nM (טעון על עמודה כרומטוגרפי של מזהה 2.1 מ מ 1 femtomole) בנוכחות פפטיד גבוהה-שפע רקע (2 µg של mAb תקציר טעון בעמודה). על ידי שילוב HRMS יישוב וגם יון ניידות קודמן ההפרדה, וזמינותו HS-MRM פוטנציאל גדול להפוך assay ניטור מהיר, תפוקה גבוהה עבור HCPs מרובות מעבר למספר אצוות של תכשירי ביו.
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצה להודות לסלי Malouin, טוני Catlin מתאגיד המים עבור הכנת איור 6 של כתב היד.
Vion IMS Qtof mass spectrometer | Waters | 186009214 | |
Acquity H-Class Quaternary solvent manager (QSM) | Waters | 186015041 | |
Acquity H-Class FTN Sample Manager (SM) | Waters | 186015040 | |
Acquity H-Class Column Manager (CM) | Waters | 186015043 | |
Acetonitrile (ACN) | Fisher Chemical | A996-4 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 40867-50G-F | |
2.1 x 150 mm CSH C18 UPLC column, 1.8 µm particles | Waters | 186005298 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
Formic acid, eluent additive for LC/MS | Sigma Aldrich | 56302-10X1ML-F | |
Hi3 rabbit phosphorylase (PHO) MassPREP standard | Waters | 186006011 | |
Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | I-1149-5G | |
LC vials (12×32 mm glass vials, screw neck) | Waters | 186000327c | |
Leucine Enkephalin acetate salt hydrate | Sigma Aldrich | L9133-10MG | |
Protein LoBind 2.0 mL tubes (2×50) | Eppendorf | 22431102 | |
RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
Trypsin/Lys-C enzyme mix, mass spec grade (5 x 20 µg) | Promega | V5073 | |
Water, LC/MS grade | Sigma Aldrich | 39253-1L-R |