Культура взрослых Трансгенные данио Ретинального эксплантов для живых клеток изображений многофотонной микроскопии

Summary

Данио регенерации сетчатки в основном были изучены с использованием фиксированных сетчатку. Однако динамические процессы, такие как интеркинетического ядерной миграции происходят во время рекуперативного ответа и требуют живых клеток, чтобы исследовать основные механизмы. Здесь мы описываем культуру и условия формирования изображения для мониторинга интеркинетического ядерной миграции (НИМ) в режиме реального времени с использованием многофотонный микроскопии.

Abstract

Эндогенная программа регенерации инициируется Müller глии в взрослых данио (Danio rerio) сетчатка следующие повреждения нейронов и смерти. Глии Мюллера вновь войти в клеточный цикл и производят нейрональные клетки-предшественники, которые претерпевают последующих раундов клеточных делений и дифференцируются в потерянных нейрональных типов клеток. Оба Müller глии и нейронов клеток – предшественников ядер реплицировать свою ДНК и подвергаются митоза в различных местах сетчатки, то есть они мигрируют между базальной Внутренний ядерный слой (INL) и наружный ядерный слой (ONL), соответственно, в способе , описанном в интеркинетического Ядерная миграция (INM). INM в основном была изучена в развивающейся сетчатке. Для изучения динамики INM во взрослом регенерирующим данио сетчатку в деталях, живых клеток изображений флуоресцентно-меченых Мюллер глии / нейрональных клеток-предшественников требуется. Здесь мы предоставляем условия для выделения и культуры спинные сетчаткуот Tg [GFAP: nGFP] ^mi2004 данио , которые подвергались воздействию постоянного интенсивного света в течение 35 часов. Мы также показали , что эти культуры сетчатки являются жизнеспособными для проведения экспериментов визуализации живых клеток, постоянно приобретая Z-стек изображений по всей толщине эксплантов сетчатки глаза до 8 ч с использованием многофотонной микроскопии для наблюдения за миграционную поведение GFAP: nGFP -положительным клетки , Кроме того, мы описываем детали для проведения анализа после обработки изображений для определения скорости апикальной и базальной INM. Подводя итог, мы создали условия для изучения динамики INM во взрослой модели регенерации нейронов. Это позволит углубить наше понимание этого ключевого клеточного процесса и позволяют определить механизмы, которые контролируют INM.

Introduction

В отличие от людей, данио (Danio rerio) демонстрируют надежный ответ регенерации на гибель клеток нейронов сетчатки ^{1, 2, 3, 4.} Фактор некроза опухоли α, сигнальная молекула , которая высвобождается от смерти нейронов сетчатки индуцирует Müller глии проживающее в базальном Внутренний ядерный слой (INL) сетчатки, пролиферировать ⁵ и производить нейрональных клеток – предшественников , которые продолжают разрастаться до того дифференцироваться в нейронную клетку типы , которые умерли ^{2, 3, 4.} Во время пролиферативной фазы реакции регенерации, ядра Müller глии и их производные нейрональные клетки – предшественники проходят повторяющиеся миграционную картину в фазе с клеточного цикла (интеркинетического миграции ядер, INM) ⁶ </sup ^{>, 7.} Ядра расположены в базальной INL реплицировать свою ДНК, прежде чем переходить к наружному ядерный слой (ONL), где они делят до того, как возникающие ядра возвращают базально к INL. Этот процесс был впервые описан в ходе нейроэпителиальной разработки с использованием гистологических методов, в то время как методы визуализации живых клеток позже подтвердил толкование Sauer ^{8, 9, 10, 11, 12.} Обе гистохимические и живых клеток подходы формирования изображений используются для определения механизмов , лежащих INM и его функции в развитии нейроэпителия включая сетчатку ^{9, 11, 12, 13.} Однако механизмы, регулирующие INM во взрослом регенерирующейся сетчатку не были изучены достаточно подробноXref "> ^{6, 7.} живых клеток будет неоценимым подход для продвижения наших знаний о сигнальных путей , которые контролируют INM во взрослом регенерирующей сетчатки.

До недавнего времени живой ячейки изображения INM в сетчатке не был ограничен либо живых эмбрионов данио или к эмбриональной птенца или послеродового мыши эксплантатов сетчатки глаза ^{9, 10, 11, 12, 14, 15, 16.} В то время как эксплантов сетчатки глаза от взрослых животных разных видов , включая мышей, крыс и данио были использованы для различных клетки биологические подходы ^{17, 18, 19, 20,} эксперименты живых клеток с использованием эксплантатов сетчатки глаза гаве были ограничены короткими периодами времени и не выполняется непрерывно в течение нескольких часов ^{21, 22.} Здесь мы описываем подробный протокол к культуре легких поврежденных взрослых данио сетчатке для проведения экспериментов живых клеток изображений INM мониторинга с использованием мульти-фотонной микроскопии ^6. Подходы живых клеток имеют преимущество перед иммуногистохимических методов при исследовании механизмов , контролирующих INM, как динамика INM, например, скорости могут быть затронуты , а не место митоза, который бы не потенциально быть обнаружены с помощью иммуноцитохимии.

В дальнейшем, этот метод также имеет потенциал, чтобы быть модифицирована для изучения других динамических процессов во время регенерации сетчатки, такие как фагоцитоз смерти фоторецепторов Мюллером глии или поведение микроглии.

Protocol

Примечание: рерио были подняты и поддерживается на объекте Нотр-Дам данио в области наук о жизни Центра Freimann. Методы, описанные в этой рукописи утверждаются Университета Нотр-Дам уходу и использованию животных комитета и в соответствии с заявлением для использования животных в научны?…

Representative Results

Выделение сетчатки в соответствии с процедурой , описанной в схеме на фиг.1 , позволяет культивирование уплощенной дорсальной части сетчатки от светло-поврежденных взрослых Tg [GFAP: nGFP] mi2004 данио в течение не менее 24 ч в 5% СО в 2 / воздушная среда. Э…

Discussion

Исследования , расследующие механизмы , регулирующие регенерацию поврежденных взрослых данио сетчатки глаза преимущественно используются иммуноцитохимической методы ^{5, 25, 26, 27, 28, <…}

Materials

Dumont forceps size #5	World precision instruments	14098
Dumont forceps size #5, 45° angle	World precision instruments	14101
McPherson-Vannas scissors	World precision instruments	501233
Fluordishes	World precision instruments	FD35-100
Stereomicroscope	Nikon	SMZ-1B	similar type of dissection stereomicroscope will work
Biological Safety Cabinet class type A2	Labconco		equivalent type will work
tissue culture incubator	Thermoscientific	HEPA-class 100	equivalent type will work
Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO	Bulbtronics	31850
0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter	VWR	4192
10 ml Luer-lok syringe	VWR	BD309604
60 ml Luer-lok syringe	VWR	BD309653
NaHCO3	FischerScientific	S233-500
CaCl2	ThermoScientific	C79-500
MgCl2	EMD Millipore	5980
HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco	ThermoScientific	14175-095
MEM w/o phenol red, Gibco	ThermoScientific	5100-038
Horse serum, heat-inactivated	ThermoScientific	26050-070
penicillin/streptomycin	VWR	16777-164
Ultrapure low melting point agarose	ThermoScientific	16520-100
ethanol, absolute	ThermoScientific	BP2818-4
2-phenoxyethanol	Sigma	77699
Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive	VWR	354240
refractive index liquid	Cargille Lab	1803Y
Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser	Nikon		equivalent system will work
40x Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15)
environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes	Okolab		equivalent system will work
NIS analysis software	Nikon