Culture of Adult Transgene Sebrafisk Netthinne explants for Live-celle Imaging av multiphoton Mikros

Summary

Sebrafisk retinal regenerasjon har for det meste blitt undersøkt ved hjelp av faste netthinner. Men dynamiske prosesser som interkinetic atom migrasjon oppstår under regenerativ respons og krever levende celle bildebehandling for å undersøke de underliggende mekanismene. Her beskriver vi kultur og bilde forhold til å overvåke Interkinetic Nuclear Migration (INM) i sanntid ved hjelp multiphoton mikroskopi.

Abstract

En endogen regenerering Programmet er initiert av Müller gliaceller i den voksne sebrafisk (Danio rerio) hinnen etter neuronal skade og død. De Müller gliaceller re-gå inn i cellesyklus og produsere nevrale stamceller som gjennomgår påfølgende runder av celledelinger og differensiere inn de tapte nevronale celletyper. Både Müller gliaceller og nevronale stamfar cellekjerner kopiere deres DNA og gjennomgå mitose i forskjellige steder i netthinnen, dvs. de vandrer mellom basal Indre Nuclear Layer (INL) og Ytre Nuclear Layer (onl), henholdsvis i en prosess beskrevet som Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM har hovedsakelig blitt studert i utviklingshinnen. For å undersøke dynamikken i INM i den voksne regenererende sebrafisk netthinnen i detalj, er levende celle avbildning av fluoresceinmerkede Müller gliaceller / nevrale stamceller nødvendig. Her gir vi betingelsene for å isolere og kultur rygg netthinnefra Tg [GFAP: nGFP] ^mi2004 sebrafisk som ble utsatt for konstant intens lys for 35 timer. Vi viser også at disse retina kulturer er levedyktig for å utføre levende celle bildebehandling eksperimenter, kontinuerlig å anskaffe z-stack-bilder i hele tykkelsen av retinal eksplantat i opptil 8 timer under anvendelse av multiphoton mikroskopi for å overvåke vandringsadferd av GFAP: nGFP-positive celler . I tillegg beskriver vi detaljene til å utføre post-bildeanalyse for å bestemme hastigheten av apikale og basal INM. For å oppsummere, etablerte vi forutsetninger for å studere dynamikken i INM i en voksen modell av neuronal regenerering. Dette vil fremme vår forståelse av denne viktige cellulære prosessen og tillate oss å bestemme hvilke mekanismer som styrer INM.

Introduction

I motsetning til mennesker, sebrafisk (Danio rerio) viser en robust regenerering svar på celledød av netthinnens nerveceller ^{1, 2, 3, 4.} Tumornekrosefaktor α, et signalmolekyl som frigjøres fra å dø netthinnens nerveceller induserer Müller gliaceller bosatt i basal Indre Nuclear Layer (INL) av netthinnen, for å spre ^fem og produsere nevrale stamceller som fortsetter å spre seg før differensiere inn i nevronale celle typer som døde ^{2, 3, 4.} Under den proliferative fase av regenereringen respons, kjerner av Müller gliaceller og deres avledet neuronal forløperceller gjennomgå et repeterende mønster trekkende i fase med cellesyklusen (Interkinetic Nuclear Migration, INM) ⁶ </sup > ^7. Kjerner plassert i basal INL kopiere deres DNA før migrere til ytre Nuclear Layer (onl) hvor de deler før de oppstår atomkjerner tilbake basalt til INL. Denne fremgangsmåten ble først beskrevet under neuroepithelial utvikling ved hjelp av histologiske metoder, mens levende celle bildedannende fremgangsmåter senere bekreftet tolkningen av Sauer ^{8, 9, 10, 11, 12.} Både histokjemiske og lever-cellebilde tilnærminger er blitt benyttet for å bestemme mekanismene bak INM og dens funksjon i å utvikle neuroepithelia herunder netthinnen ^{9, 11, 12, 13.} Imidlertid har de mekanismene som styrer INM i voksen regenererende hinnen ikke blitt undersøkt i mye detaljxref "> ^{6, 7.} Lev-cell imaging vil være en uvurderlig måte å fremme vår kunnskap om signalveier som styrer INM i voksen regenererende hinnen.

Inntil nylig var levende celle avbildning av INM i netthinnen begrenset til enten levende sebrafisk embryo eller foster dama eller postnatal mus retinal explants ^{9, 10, 11, 12, 14, 15, 16.} Mens retinal explants fra voksne dyr av ulike arter, inkludert mus, rotte og sebrafisk har blitt utnyttet for annen celle biologiske tilnærminger ^{17, 18, 19, 20,} live-cell imaging eksperimenter med retinal eksplanter hahar vært begrenset til korte perioder av gangen, og har ikke blitt utført kontinuerlig over flere timer ^{21, 22.} Her beskriver vi en detaljert protokoll til kultur lys-skadet voksne sebrafisk netthinner å opptre live-celle bildebehandling eksperimenter overvåking INM ved hjelp av multi-foton mikroskopi ^6. Levende celler bilde tilnærminger er fordelaktig i forhold immunhistokjemiske metoder når undersøke hvilke mekanismer som styrer INM, som dynamikken i INM, f.eks hastigheter kan bli påvirket snarere enn plasseringen av mitose, som ville potensielt ikke oppdages ved hjelp immunocytochemistry.

I fremtiden, har denne fremgangsmåte også potensiale til å bli modifisert for å studere andre dynamiske prosesser i løpet av retinal regenerasjon, slik som fagocytose av døende fotoreseptorene hos Müller gliaceller eller oppførselen til mikroglia.

Protocol

Merk: Sebrafisk ble reist og vedlikeholdes i Notre Dame Sebrafisk-anlegget i Freimann Life Sciences Center. Metodene som er beskrevet i dette manuskriptet er godkjent av University of Notre Dame Animal Care og bruk Committee og er i samsvar med uttalelsen for bruk av dyr i et syn forskning av Association for Research in Vision og oftalmologi. 1. Solutions Forbered 70% etanol for å sterilisere vevskultur panseret og noe utstyr / reagenser som overføres inn i vev kultur hette. </l…

Representative Results

Isoleringen av netthinnen i henhold til fremgangsmåten beskrevet i skjematisk på figur 1 tillater dyrkning av en flat rygg retina fra lys-skadet voksen Tg [GFAP: nGFP] mi2004 sebrafisk i løpet av en periode på minst 24 timer i en 5% CO 2 / luft. Disse flat-monterte retinal explants kan brukes til bildefokusplan på dype vev nivåer. Et eksempel er Müller gliaceller / nervestamcellekjerner merkes med GFP fra Müller glia-spesifikke prom…

Discussion

Studier som undersøker de mekanismene som styrer regenerering av skadet voksen sebrafisk netthinnen hovedsakelig brukte immunocytokjemiske metoder ^{5, 25, 26, 27, 28, 29, 30.} Etablering forhold til kultur retinal explants og å opptre live-cell imaging på fenomener som INM, gi oss en tekni…

Materials

Dumont forceps size #5	World precision instruments	14098
Dumont forceps size #5, 45° angle	World precision instruments	14101
McPherson-Vannas scissors	World precision instruments	501233
Fluordishes	World precision instruments	FD35-100
Stereomicroscope	Nikon	SMZ-1B	similar type of dissection stereomicroscope will work
Biological Safety Cabinet class type A2	Labconco		equivalent type will work
tissue culture incubator	Thermoscientific	HEPA-class 100	equivalent type will work
Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO	Bulbtronics	31850
0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter	VWR	4192
10 ml Luer-lok syringe	VWR	BD309604
60 ml Luer-lok syringe	VWR	BD309653
NaHCO3	FischerScientific	S233-500
CaCl2	ThermoScientific	C79-500
MgCl2	EMD Millipore	5980
HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco	ThermoScientific	14175-095
MEM w/o phenol red, Gibco	ThermoScientific	5100-038
Horse serum, heat-inactivated	ThermoScientific	26050-070
penicillin/streptomycin	VWR	16777-164
Ultrapure low melting point agarose	ThermoScientific	16520-100
ethanol, absolute	ThermoScientific	BP2818-4
2-phenoxyethanol	Sigma	77699
Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive	VWR	354240
refractive index liquid	Cargille Lab	1803Y
Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser	Nikon		equivalent system will work
40x Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15)
environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes	Okolab		equivalent system will work
NIS analysis software	Nikon