Das<em> Ex Vivo</em> Colon Organ Culture und seine Verwendung in Antimicrobial-Host Defense Studies
Summary
The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.
Abstract
Der Darm zeigt eine Architektur von repetitiven Krypta Strukturen, die aus verschiedenen Typen von Epithelzellen, Lamina Propria Immunzellen enthalten, und Stroma. Alle diese heterogenen Zellen tragen dazu bei, antimikrobielle Abwehrdarm Homöostase und daran teilzunehmen. Daher ist für das Studium Immunantwort und antimikrobielle Aktivität des Darmes in einem in vitro – Einstellung ein Ersatzmodell identifizieren , ist extrem schwierig. In – vitro – Studien mit verewigte Darmepithel – Zelllinien oder auch primäre Krypta organoiden Kultur nicht die genaue Physiologie der normalen Darm und seine Mikroumgebung darstellen. Hier haben wir ein Verfahren zum Kultivieren der Maus Kolongewebe in einer Kulturschale und darüber , wie diese ex vivo – Organkultursystem kann in Studien durchgeführt werden in Bezug auf antimikrobielle Wirtsabwehrreaktionen. In repräsentativen Experimenten haben wir gezeigt, dass Doppelpunkte in Organkultur exprimieren antimikrobiellen Peptiden in bzw.onse auf exogenes IL-1β und IL-18. Die antimikrobiellen Effektor – Molekülen durch den Dickdarm Gewebe in der Organkultur produziert effizient Escherichia coli in vitro Ferner töten. Dieser Ansatz kann daher genutzt werden, um die Rolle der pathogen und Gefahren associated molecular patterns und ihre zellulären Rezeptoren bei der Regulierung der Darm angeborenen Immunantwort und antimikrobielle Abwehrreaktionen zu sezieren.
Introduction
Der Darm stellt ein dynamisches System , das für commensal Mikroorganismen als Barriere wirkt, kämpft gegen eindringende Krankheitserreger, und reguliert die mikrobielle Zusammensetzung 1. Die intestinalen Epithelzellen, bestehend aus Enterozyten, Becherzellen, Panethzellen und enteroendokrinen Zellen sind die Hauptzellpopulationen, die Abwehrreaktionen gegen Darmmikrobiota liefern. Die Becherzellen produzieren Muzine , die eine entmilitarisierte Zone auf der Oberseite der Epithelschicht 2 erstellen. Die Panethzellen und Enterozyten produzieren antimikrobielle Peptide, Zytokine und reaktive Sauerstoff und Stickstoff – Spezies , die eine antimikrobielle Abwehrreaktionen darstellen und tragen 3, die Darmflora 4 zu formen. Zusätzlich zu Epithelzellen, die Immunzellen, einschließlich Makrophagen, dendritische Zellen, Neutrophile, natürliche Killerzellen, Lymphozyten und inna te lymphatischen Zellen in der Lamina propria und Submukosa durch die Herstellung Zytokinen, Chemokinen eine entscheidende Rolle bei Darm-antimikrobielle Abwehrreaktionen spielen, und andere Vermittler fähig 5 – 7. Um zu verstehen, wie die Schleimhaut Immunsystem reguliert Mikrobiota und bietet Schutz gegen mikrobielle Infektionen, ist es wichtig, das komplexe Zusammenspiel der heterogenen Zellpopulationen des Darms zu berücksichtigen. Jedoch ist ein in vitro – Modell , das alle Merkmale des Darmes umfasst ist nicht verfügbar. Daher sind molekulare Untersuchungen auf Wirt-Pathogen-Interaktion im Darm sehr herausfordernd.
In den letzten Jahren mehrere Modellsystemen , die Aspekte der Darmschleimhaut zu imitieren wurden zur Untersuchung der pathophysiologischen Prozesse bei entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) und anderen gastrointestinalen Störungen 8 entwickelt –= "xref"> 14. Immortalized Darmepithel-Zelllinien werden oft zu studieren epithelialen Zell-spezifische Antworten verwendet. Wegen der differentiellen Genexpression und Funktion in immortalisierten Zellen jedoch die erhaltenen Daten aus diesen Zellen unter Verwendung von nicht mit denen häufig in in vivo Studien beobachtet entsprechen. Intestinale Krypta organoiden Kultur wurde als mögliches Instrument zur Beurteilung der Reaktion des Darmepithels auf verschiedene Reize 13 kürzlich entstanden. In diesem System werden Krypta Stammzellen erlaubt eine 3D-organoiden Struktur zu wachsen und sich entwickeln. Während die organoiden Kultursystem für die Untersuchung vieler Aspekte des Darmepithels sehr nützlich ist, ist es nicht die komplexe Interaktion von Immunzellen, Epithelzellen und mikrobielle Produkte nachahmen. Die ex vivo Kultur des Darmgewebe bietet eine bessere Darstellung der in vivo – Wirtsabwehrreaktionen. In diesem Verfahren wird ein Teil des Darms kultiviert in einer Zellkulturplatte with geeigneten Medien, die verschiedenen Arten von Zellpopulationen im Darm ermöglichen, aktiv zu sein metabolisch für mindestens 48 h. Somit kann eine ex vivo – Kultur des Organs kann verwendet werden , um die Expression von antimikrobiellen Genen und die Abwehrreaktionen des Darmes auf einen bestimmten Reiz zu messen.
Die Ermittler haben die Ex – vivo – Organkultursystem unter Verwendung von zu Abwehrreaktionen gegen mikrobielle Infektion im Darm 15 studieren – 21. Wir nahmen kürzlich die Organkultursystem die Rolle des Inflammasoms in antimikrobiellen Abwehrreaktionen in Maus Doppelpunkte 22 zu studieren. Die Inflammasoms ist eine molekulare Plattform für die Aktivierung von Caspase-1, die für die Produktion von IL-1β gereift und IL-18 benötigt wird. Wir haben gezeigt , dass IL-1β und IL-18 antimikrobielle Peptide induzieren , die effektiv commensal pathobionts wie E. coli töten </em>. Diese Beobachtung wurde im Einklang mit einer erhöhten Belastung E. coli in Inflammasoms defekten Maus Doppelpunkte 22. Dieses System kann daher verwendet werden, um die Rolle der Mustererkennungsrezeptoren (PRRS) und andere angeborene Immunmoleküle in intestinalen antimikrobielle Wirtsabwehrreaktionen zu untersuchen sowie Pathogenese von intestinalen Erkrankungen, wie entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) und Darmkrebs (CRC). Es gibt mehr als 200 IBD Suszeptibilitätsgene, und Mutationen in vielen dieser Gene mit veränderten mikrobiellen Zusammensetzung im Darm verbunden sind. Es ist von großer klinischer Bedeutung, die genaue Mechanismus, durch den die IBD-Anfälligkeit Gene regulieren Darmflora zu bestimmen. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Basisprotokoll von Ex – vivo – Kolon Organkultur einzuführen und zu zeigen , wie diese Kulturverfahren verwendet werden können antimikrobielle Abwehrreaktionen des Darms zu studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die intestinalen Epithelzellen sind sehr empfindlich in Bezug auf ihre Wachstumsanforderungen und daher schwierig zu kultivieren. Die Epithelzellen isoliert durch EDTA – Behandlung nicht überleben in konventionellen Zellkulturmedien , wie beispielsweise DMEM 8. Daher Wirt-Pathogen-Interaktion Studien isoliert Krypta oder primäre Epithelzellen sind sehr anspruchsvoll. Vor kurzem Sato et al. eine Krypta organoiden Kultursystem beschrieben , die für Studien im Zusammenhang mit Darm Pathophysiolog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT; RP160169) und UT Southwestern Medical Center zu MHZ gegeben; Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung von Morbus Crohn und Colitis Foundation of America (3711 CCFA) unterstützt
Materials
| Advanced DMEM/ F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride | Sigma | 5634 | |
| FBS, heat inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| Mouse IL-1b recombinan | Reprokine | RKP10749 | |
| Mouse IL-18 recombinant | Reprokine | RKP70380 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Difco Luria-Bertani Broth | BD Bioscience | 244620 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar | Fisher Scientific | DF0075-17-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Uded to measure RNA concentration | |
| UV/Vis Spectrophotometer | BECKMAN | DU 530 | Used to determine E. coli count |
| iScript RT Supermix, 100 rxns | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Univer SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | |
| Lysing Matrix S (1/8"), 2 mL Tube | MP Biomedicals | 116925500 | Used to homgenize colon organ for RNA isolation |
| FastPrep-24 5G System | Bio-Rad | 116005500 | |
| 100×15 Petri Dish | Falcon | 5687 | |
| Plate 6well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile | Cellstar | 5085 | |
| 100 micron cell strainer | Falcon | 5698 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sorvall ST40R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Forma Scientific orbital shaker | Thermo Fisher Scientific |
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