De<em> Ex Vivo</em> Colon Organ Cultuur en het gebruik ervan in Antimicrobial Host Defensie Studies
Summary
The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.
Abstract
De darm toont een architectuur van repetitieve crypt die bestaan uit verschillende epitheelcellen, lamina propia met immuuncellen en stroma. Al deze heterogene cellen bijdragen tot intestinale homeostase en deelnemen aan antimicrobiële afweer. Daarom identificeren van een surrogaat model voor de studie immuunrespons en antimicrobiële activiteit van de darm in een in vitro omgeving is zeer uitdagend. In vitro studies met onsterfelijk intestinale epitheliale cellijnen of zelfs primaire crypt organoïde cultuur niet de exacte fysiologie van de normale darm en de micro-omgeving vertegenwoordigen. Hier bespreken we een methode voor het kweken van de muis colon weefsel in een cultuur schotel en hoe deze ex vivo orgelcultuur systeem kan in studies met betrekking tot antimicrobiële afweer reacties worden uitgevoerd. In representatieve experimenten, hebben we laten zien dat dubbele punten in orgelcultuur uitdrukken antimicrobiële peptiden in response exogene IL-1β en IL-18. Verder kan de antimicrobiële effector moleculen door de colon weefsels in de orgaankweek efficiënt doden Escherichia coli in vitro. Deze benadering kan dus worden gebruikt om de rol van pathogeen en gevaar geassocieerde moleculaire patronen en hun cellulaire receptoren ontleden reguleren intestinale aangeboren immuunresponsen en antimicrobiële afweer reacties.
Introduction
De darm is een dynamisch systeem dat fungeert als een barrière voor commensale microörganismen, vecht tegen binnendringende pathogenen, en regelt de microbiële samenstelling 1. De intestinale epitheelcellen, bestaande uit enterocyten, goblet cellen, Paneth cellen en entero-endocriene cellen, zijn de belangrijkste cel populaties die afweer responsen tegen darmmicrobiota bieden. De slijmbekercellen mucinen produceren dat een gedemilitariseerde zone aan de bovenkant van de epitheellaag 2 maken. De Paneth cellen en enterocyten produceren antimicrobiële peptiden, cytokinen en reactieve zuurstof en stikstof soorten die antimicrobiële afweer reacties vormen en bijdragen aan het vormgeven van de intestinale microbiële samenstelling 3, 4. Naast epitheelcellen, de immuuncellen zoals macrofagen, dendritische cellen, neutrofielen, NK cellen, lymfocyten en inna te lymfoïde cellen in de lamina propria en submucosa spelen een cruciale rol in de intestinale antimicrobiële afweer reacties door het produceren van cytokines, chemokines, en andere bemiddelaars 5-7. Om te begrijpen hoe het mucosale immuunsysteem reguleert microbiota en biedt bescherming tegen microbiële infectie, is het belangrijk om de complexe interactie van de heterogene celpopulaties van de darm te overwegen. Echter, een in vitro model dat alle functies van de darm omvat niet beschikbaar. Daarom moleculaire studies op gastheer-pathogeen interactie in de darm zeer uitdagend.
In de afgelopen jaren hebben verschillende modelsystemen die aspecten van het darmslijmvlies nabootsen ontwikkeld voor het onderzoeken van de pathofysiologische processen die betrokken zijn bij inflammatoire darmziekten (IBD) en andere gastro-intestinale aandoeningen 8 –= "xref"> 14. Geïmmortaliseerde intestinale epitheliale cellijnen worden vaak gebruikt om epitheelcellen specifieke responsen bestuderen. Vanwege differentiële genexpressie en functie in geïmmortaliseerde cellen, de gegevens van het gebruik van die cellen niet vaak overeenkomen met die waargenomen bij in vivo studies. Intestinale crypte organoïde cultuur recentelijk naar voren gekomen als een potentieel middel voor het beoordelen van de respons van het darmepitheel verschillende stimuli 13. In dit systeem worden crypte stamcellen kunnen groeien en ontwikkelen een 3D organoïde structuur. Terwijl het organoïde kweeksysteem is zeer nuttig voor het bestuderen van verschillende aspecten van het darmepitheel, is het niet de complexe interactie van immune cellen, epitheelcellen en microbiële producten imiteren. De ex vivo cultuur van het darmweefsel biedt een betere vertegenwoordiging van in vivo afweer reacties. In deze werkwijze wordt een deel van de darm wordt gekweekt in een celcultuur plaat with geschikte media waardoor de verschillende celpopulaties in de darm metabolisch actief gedurende ten minste 48 uur. Aldus kan een ex vivo kweek van het orgaan worden gebruikt om de expressie van antimicrobiële genen en de afweer reacties van de darm aan een bepaalde stimulus te meten.
De onderzoekers zijn met behulp van het ex vivo orgelcultuur systeem om de afweer responsen tegen microbiële infectie te bestuderen in de darm 15-21. We hebben onlangs de orgelcultuur systeem goedgekeurd om de rol van de inflammasoom in antimicrobiële afweer reacties in muizen dubbele punten 22 bestuderen. De inflammasoom is een moleculaire platform voor de activering van caspase-1, die nodig is voor de productie van gerijpte IL-1β en IL-18. We toonden aan dat IL-1β en IL-18 induceren antimicrobiële peptiden die effectief commensale pathobionts doden zoals E. coli </em>. Deze waarneming was in overeenstemming met verhoogde E. coli lasten in inflammasoom-defecte muis dubbele punten 22. Dit systeem kan daarom worden gebruikt om de rol van receptoren patroonherkenning (PRRS) en andere aangeboren immuunsysteem moleculen in intestinale antimicrobiële afweer reacties en pathogenese van intestinale aandoeningen te bestuderen zoals ontstekingsdarmziekte (IBD) en colorectale kanker (CRC). Er zijn meer dan 200 IBD gevoelige genen en mutaties in veel van deze genen zijn geassocieerd met veranderde microbiële samenstelling in de darm. Het is van groot klinisch belang om het precieze mechanisme waardoor het IBD-gevoelige genen reguleren darmflora te bepalen. Het algemene doel van deze methode is om een basisprotocol van ex vivo colon orgaankweek introduceren en te demonstreren hoe dit kweekmethode kan worden gebruikt voor antimicrobiële afweer reacties van de darm te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De intestinale epitheliale cellen zeer gevoelig wat betreft hun groei eisen en derhalve moeilijk te kweken. De epitheelcellen geïsoleerd door EDTA behandeling niet overleven in de conventionele celcultuur media, zoals DMEM 8. Daarom gastheer-pathogeen interactie studies met behulp van geïsoleerde crypte of primaire epitheliale cellen zijn zeer uitdagend. Onlangs, Sato et al. beschreef een crypte organoïde cultuur systeem dat is veelbelovend en nuttig voor studies met betrekking tot intestinale…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de financiering van de Crohn en Colitis Foundation of America, (CCFA; 3711) Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT; RP160169) en UT Southwestern Medical Center gegeven aan MHZ
Materials
| Advanced DMEM/ F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride | Sigma | 5634 | |
| FBS, heat inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| Mouse IL-1b recombinan | Reprokine | RKP10749 | |
| Mouse IL-18 recombinant | Reprokine | RKP70380 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Difco Luria-Bertani Broth | BD Bioscience | 244620 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar | Fisher Scientific | DF0075-17-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Uded to measure RNA concentration | |
| UV/Vis Spectrophotometer | BECKMAN | DU 530 | Used to determine E. coli count |
| iScript RT Supermix, 100 rxns | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Univer SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | |
| Lysing Matrix S (1/8"), 2 mL Tube | MP Biomedicals | 116925500 | Used to homgenize colon organ for RNA isolation |
| FastPrep-24 5G System | Bio-Rad | 116005500 | |
| 100×15 Petri Dish | Falcon | 5687 | |
| Plate 6well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile | Cellstar | 5085 | |
| 100 micron cell strainer | Falcon | 5698 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sorvall ST40R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Forma Scientific orbital shaker | Thermo Fisher Scientific |
References
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Vaishnava, S., Behrendt, C. L., Ismail, A. S., Eckmann, L., Hooper, L. V. Paneth cells directly sense gut commensals and maintain homeostasis at the intestinal host-microbial interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20858-20863 (2008).
- Kamada, N., Chen, G. Y., Inohara, N., Nunez, G. Control of pathogens and pathobionts by the gut microbiota. Nat Immunol. 14, 685-690 (2013).
- Wu, H. J., Wu, E. The role of gut microbiota in immune homeostasis and autoimmunity. Gut Microbes. 3, 4-14 (2012).
- Zimmerman, N. P., Vongsa, R. A., Wendt, M. K., Dwinell, M. B. Chemokines and chemokine receptors in mucosal homeostasis at the intestinal epithelial barrier in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 14, 1000-1011 (2008).
- Elliott, D. E., Siddique, S. S., Weinstock, J. V. Innate immunity in disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 749-755 (2014).
- Chopra, D. P., Dombkowski, A. A., Stemmer, P. M., Parker, G. C. Intestinal epithelial cells in vitro. Stem Cells Dev. 19, 131-142 (2010).
- Autrup, H. Explant culture of human colon. Methods Cell Biol. 21, 385-401 (1980).
- Qin, J., et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature. 464, 59-65 (2010).
- Wildenberg, M. E., vanden Brink, G. R. A major advance in ex vivo intestinal organ culture. Gut. 61, 961-962 (2012).
- Leushacke, M., Barker, N. Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications. Gut. 63, 1345-1354 (2014).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. 61, 1007-1015 (2012).
- Haque, A., et al. Early interactions of Salmonella enterica serovar typhimurium with human small intestinal epithelial explants. Gut. 53, 1424-1430 (2004).
- Hicks, S., Candy, D. C., Phillips, A. D. Adhesion of enteroaggregative Escherichia coli to pediatric intestinal mucosa in vitro. Infect Immun. 64, 4751-4760 (1996).
- Knutton, S., Lloyd, D. R., Candy, D. C., McNeish, A. S. In vitro adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli to human intestinal epithelial cells from mucosal biopsies. Infect Immun. 44, 514-518 (1984).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J Anat. 134, 459-469 (1982).
- Smollett, K., Shaw, R. K., Garmendia, J., Knutton, S., Frankel, G. Function and distribution of EspG2, a type III secretion system effector of enteropathogenic Escherichia coli. Microbes Infect. 8, 2220-2227 (2006).
- Bareiss, P. M., et al. Organotypical tissue cultures from adult murine colon as an in vitro model of intestinal mucosa. Histochem Cell Biol. 129, 795-804 (2008).
- Tsilingiri, K., Sonzogni, A., Caprioli, F., Rescigno, M. A novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants. J Vis Exp. , e4368 (2013).
- Hu, S., et al. The DNA Sensor AIM2 Maintains Intestinal Homeostasis via Regulation of Epithelial Antimicrobial Host Defense. Cell Rep. 13, 1922-1936 (2015).
- Moorghen, M., Chapman, M., Appleton, D. R. An organ-culture method for human colorectal mucosa using serum-free medium. J Pathol. 180, 102-105 (1996).
- Dame, M. K., et al. Human colon tissue in organ culture: preservation of normal and neoplastic characteristics. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46, 114-122 (2010).
- Grant, A. J., Woodward, J., Maskell, D. J. Development of an ex vivo organ culture model using human gastro-intestinal tissue and Campylobacter jejuni. FEMS Microbiol Lett. 263, 240-243 (2006).
