Il<em> Ex Vivo</em> Colon Organ Culture e il suo uso in Antimicrobial Host Defense Studies
Summary
The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.
Abstract
L'intestino mostra un'architettura di strutture cripta ripetitive costituite da diversi tipi di cellule epiteliali, propia lamina contenente cellule immunitarie, e stroma. Tutte queste cellule eterogenei contribuiscono a omeostasi intestinale e partecipare a difesa ospite antimicrobica. Pertanto, l'identificazione di un modello di surrogato per studiare la risposta immunitaria e attività antimicrobica dell'intestino in un ambiente in vitro è estremamente impegnativo. Gli studi in vitro utilizzando linee cellulari epiteliali intestinali immortalato o cripta addirittura primario organoide cultura non rappresentano l'esatta fisiologia intestinale normale e del suo microambiente. Qui, si discute un metodo di tessuto del colon coltura del mouse in un piatto di cultura e di come questo organo ex vivo sistema di coltura può essere implementato in studi relativi a risposte di difesa antimicrobici ospitanti. In esperimenti di rappresentanza, abbiamo dimostrato che i due punti nella cultura d'organo esprimono peptidi antimicrobici in response per esogena IL-1β e IL-18. Inoltre, le molecole effettrici antimicrobiche prodotte dai tessuti del colon nella cultura organo uccidono efficacemente Escherichia coli in vitro. Questo approccio, pertanto, può essere utilizzato per analizzare il ruolo dei modelli molecolari di patogeni e pericolo associati ed i loro recettori cellulari nella regolazione intestinale risposte immunitarie innate e risposte di difesa antimicrobiche dell'ospite.
Introduction
L'intestino rappresenta un sistema dinamico che agisce come una barriera per i microrganismi commensali, combatte contro patogeni, e regola la composizione microbica 1. Le cellule epiteliali intestinali, composto da enterociti, cellule caliciformi, le cellule e le cellule Paneth enteroendocrine, sono le principali popolazioni di cellule che forniscono accoglienza risposte di difesa contro microbiota intestinale. Le cellule caliciformi producono mucine che creano una zona smilitarizzata sulla parte superiore dello strato epiteliale 2. Le cellule Paneth e enterociti producono peptidi antimicrobici, citochine, e specie di ossigeno e di azoto reattivo che costituiscono antimicrobici risposte di difesa dell'ospite e contribuiscano a dare forma alla composizione microbica intestinale 3, 4. In aggiunta alle cellule epiteliali, le cellule immunitarie compresi macrofagi, cellule dendritiche, neutrofili, cellule natural killer, linfociti e inna cellule linfoidi te nella lamina propria e sottomucosa giocano un ruolo critico nella intestinali risposte di difesa ospite antimicrobici da citochine, chemochine, che producono e altri mediatori 5 – 7. Per comprendere come il sistema immunitario mucosale regola microflora e fornisce protezione contro l'infezione microbica, è importante considerare la complessa interazione delle popolazioni cellulari eterogenee dell'intestino. Tuttavia, un modello in vitro che comprende tutte le caratteristiche dell'intestino non è disponibile. Pertanto, gli studi molecolari sulla interazione ospite-patogeno a livello intestinale sono altamente impegnativo.
Nel corso degli ultimi anni, diversi sistemi modello che imitano gli aspetti della mucosa intestinale sono stati sviluppati per indagare i processi fisiopatologici coinvolti nelle malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD) e altri disturbi gastrointestinali 8 –= "xref"> 14. linee di cellule epiteliali intestinali immortalati sono spesso usati per studiare le risposte specifiche delle cellule epiteliali. Tuttavia, a causa di espressione genica differenziale e funzione in cellule immortalizzate, i dati ottenuti dal usando tali cellule non coincidono spesso con quelli osservati negli studi in vivo. Cripta intestinale organoide cultura è emerso recentemente come un potenziale strumento per valutare la risposta del epitelio intestinale a stimoli diversi 13. In questo sistema, le cellule staminali cripta sono autorizzati a crescere e sviluppare una struttura organoide 3D. Mentre il sistema di coltura organoide è molto utile per studiare molti aspetti dell'epitelio intestinale, che non imita la complessa interazione di cellule immuni, cellule epiteliali e prodotti microbici. La cultura ex vivo del tessuto intestinale offre una migliore rappresentazione in vivo ospitanti risposte di difesa. In questo metodo, una parte dell'intestino è coltivato in un piatto bianco coltura cellulareh mezzi appropriati che offrano i diversi tipi di popolazioni cellulari nell'intestino di essere metabolicamente attivi per almeno 48 ore. Così, un ex vivo coltura dell'organo può essere usato per misurare l'espressione di geni antimicrobici e l'host risposte di difesa dell'intestino ad uno stimolo particolare.
Gli investigatori hanno utilizzato il sistema d'organo ex vivo della cultura per studiare ospitanti risposte di difesa contro l'infezione microbica nell'intestino 15-21. Recentemente abbiamo adottato il sistema di coltura di organi per studiare il ruolo del inflammasome nelle risposte di difesa antimicrobici ospitanti in due punti di topo 22. Il inflammasome è una piattaforma molecolare per l'attivazione della caspasi-1, che è richiesto per la produzione di IL-1β maturato e IL-18. Abbiamo dimostrato che IL-1β e IL-18 inducono peptidi antimicrobici che uccidono efficacemente pathobionts commensali come E. coli </em>. Questa osservazione è coerente con un aumento coli onere E. in due punti del mouse inflammasome-difettoso 22. Questo sistema può quindi essere utilizzato per studiare il ruolo dei recettori pattern recognition (PRR) e di altre molecole immunitarie innate in intestinali risposte di difesa ospite antimicrobici nonché patogenesi dei disturbi intestinali come la malattia infiammatoria intestinale (IBD) e il cancro del colon-retto (CRC). Ci sono più di 200 geni di suscettibilità IBD, e mutazioni in molti di questi geni sono associati con alterata composizione microbica nell'intestino. E 'di grande importanza clinica per determinare il meccanismo preciso attraverso il quale i geni IBD-suscettibilità regolano flora intestinale. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di introdurre un protocollo di base di ex vivo della cultura d'organo del colon e dimostrare come questo metodo di coltura può essere usato per studiare antimicrobici risposte di difesa ospite dell 'intestino.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le cellule epiteliali intestinali sono molto sensibili in termini di requisiti di crescita e quindi difficile da coltura. Le cellule epiteliali isolate mediante trattamento EDTA non sopravvivono in mezzi di coltura cellulare convenzionali come DMEM 8. Pertanto, studi di interazione ospite-patogeno utilizzando cripta isolata o cellule epiteliali primarie sono molto impegnativo. Recentemente, Sato et al. descritto un sistema di coltura organoide cripta che è molto promettente e utile per gli studi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento di Crohn e Colite Foundation of America, (CCFA; 3711) la prevenzione del cancro e Research Institute del Texas (CPRIT; RP160169), e UT Southwestern Medical Center dati a MHZ
Materials
| Advanced DMEM/ F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride | Sigma | 5634 | |
| FBS, heat inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| Mouse IL-1b recombinan | Reprokine | RKP10749 | |
| Mouse IL-18 recombinant | Reprokine | RKP70380 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Difco Luria-Bertani Broth | BD Bioscience | 244620 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar | Fisher Scientific | DF0075-17-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Uded to measure RNA concentration | |
| UV/Vis Spectrophotometer | BECKMAN | DU 530 | Used to determine E. coli count |
| iScript RT Supermix, 100 rxns | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Univer SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | |
| Lysing Matrix S (1/8"), 2 mL Tube | MP Biomedicals | 116925500 | Used to homgenize colon organ for RNA isolation |
| FastPrep-24 5G System | Bio-Rad | 116005500 | |
| 100×15 Petri Dish | Falcon | 5687 | |
| Plate 6well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile | Cellstar | 5085 | |
| 100 micron cell strainer | Falcon | 5698 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sorvall ST40R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Forma Scientific orbital shaker | Thermo Fisher Scientific |
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