le<em> Ex Vivo</em> Colon Organ Culture et son utilisation dans l'hôte antimicrobienne études de la défense
Summary
The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.
Abstract
L'intestin présente une architecture de structures glandulaires répétitives constituées de différents types de cellules épithéliales, de la lamina propria contenant des cellules immunitaires, et le stroma. Toutes ces cellules hétérogènes contribuent à l'homéostasie intestinale et participent à la défense de l'hôte antimicrobien. Par conséquent, l' identification d' un modèle de substitution pour l' étude de la réponse immunitaire et l' activité antimicrobienne de l'intestin dans un milieu in vitro est extrêmement difficile. Des études in vitro utilisant des lignées intestinales immortalisées de cellules épithéliales ou crypte même primaire organoide culture ne représentent pas la physiologie exacte de l' intestin normal et son microenvironnement. Ici, nous discutons d' une méthode de tissu du côlon culture de la souris dans une boîte de culture et comment cette ex vivo système de culture d'organe peut être mis en œuvre dans les études relatives aux réponses de défense de l' hôte antimicrobiens. Dans des expériences représentatives, nous avons montré que dans la culture côlons d'organes expriment des peptides antimicrobiens dans response exogène de l'IL-1β et IL-18. En outre, les molécules effectrices antimicrobiens produits par les tissus du côlon dans la culture d'organes tuent efficacement Escherichia coli in vitro. Cette approche, par conséquent, peut être utilisé pour disséquer le rôle des modèles moléculaires et de danger-pathogène-associés et leurs récepteurs cellulaires dans la régulation des réponses immunitaires innées intestinales et les réponses de défense de l'hôte antimicrobiens.
Introduction
L'intestin représente un système dynamique qui agit comme une barrière pour les micro – organismes commensaux, lutte contre les agents pathogènes envahisseurs, et régule la composition microbienne 1. Les cellules épithéliales intestinales, comprenant des entérocytes, les cellules caliciformes, des cellules de Paneth et des cellules entéro-endocrines sont les principales populations cellulaires qui fournissent des réponses de défense de l'hôte contre la microflore intestinale. Les cellules caliciformes produisent mucines qui créent une zone démilitarisée sur la partie supérieure de la couche épithéliale 2. Les cellules et les entérocytes Paneth produisent des peptides antimicrobiens, des cytokines, et des espèces d'oxygène et d' azote réactifs qui constituent les réactions de défense de l' hôte antimicrobiennes et contribuent à la mise en forme de la composition microbienne intestinale 3, 4. En plus des cellules épithéliales, les cellules immunitaires, y compris les macrophages, les cellules dendritiques, les neutrophiles, les cellules tueuses naturelles, les lymphocytes et inna les cellules lymphoïdes te dans la lamina propria et la sous – muqueuse jouent un rôle essentiel dans les réactions de défense de l' hôte antimicrobiens intestinales par des cytokines, chimiokines produisant ainsi que d' autres médiateurs 5 – 7. Afin de comprendre comment le système immunitaire de la muqueuse régule microbiote et assure une protection contre l'infection microbienne, il est important de tenir compte de l'interaction complexe des populations de cellules hétérogènes de l'intestin. Cependant, un modèle in vitro qui comprend toutes les fonctions de l'intestin ne sont pas disponibles. Par conséquent, les études moléculaires sur l'interaction hôte-pathogène dans l'intestin sont très difficiles.
Au cours des dernières années, plusieurs systèmes modèles qui simulent les aspects de la muqueuse intestinale ont été développées pour étudier les processus physiopathologiques impliqués dans les maladies inflammatoires de l' intestin (MICI) et d' autres troubles gastro – intestinaux 8 –= "xref"> 14. lignées immortalisées de cellules épithéliales de l'intestin sont souvent utilisés pour étudier les réponses spécifiques des cellules épithéliales. Toutefois, en raison de l' expression différentielle de gènes et la fonction des cellules immortalisées, les données obtenues à partir de l' utilisation de ces cellules ne correspondent pas toujours à celles observées dans les études in vivo. Crypte Intestinal organoide culture a récemment émergé comme un outil potentiel pour évaluer la réponse de l'épithélium intestinal à des stimuli différents 13. Dans ce système, les cellules souches cryptes sont autorisés à croître et à développer une structure organoide 3D. Bien que le système de culture organoïde est très utile pour l'étude de nombreux aspects de l'épithélium intestinal, il ne reproduit pas l'interaction complexe entre les cellules immunitaires, les cellules épithéliales et les produits microbiens. La culture ex vivo du tissu intestinal offre une meilleure représentation des in vivo des réponses de défense de l' hôte dans. Dans ce procédé, une partie de l'intestin est cultivée dans une culture cellulaire plaque esprith médias appropriés permettant aux différents types de populations de cellules dans l'intestin pour être métaboliquement actif pendant au moins 48 h. Ainsi, une culture ex vivo de l'organe peut être utilisé pour mesurer l'expression des gènes antimicrobiens et les réactions de défense de l' hôte de l'intestin à un stimulus particulier.
Les enquêteurs ont eu recours à l'ex vivo système de culture d'organe pour étudier les réactions de défense de l' hôte contre l' infection microbienne dans l'intestin 15-21. Nous avons récemment adopté le système de culture d'organe pour étudier le rôle de l'inflammasome dans les réponses de défense de l' hôte antimicrobiens chez les colons de souris 22. Inflammasome est une plate-forme moléculaire pour l'activation de la caspase-1, qui est nécessaire pour la production d'une maturation de l'IL-1β et IL-18. Nous avons montré que l' IL-1β et IL-18 induisent des peptides antimicrobiens qui tuent efficacement pathobiontes commensales telles que E. coli </em>. Cette observation est conforme à l' augmentation E. coli charge dans côlons de souris 22 inflammasome-défectueux. Ce système peut donc être utilisé pour étudier le rôle des récepteurs de reconnaissance des formes (PRR), et d'autres molécules immunitaires innées dans les réactions de défense de l'hôte antimicrobiens intestinaux ainsi que pathogenèse de troubles intestinaux tels que la maladie inflammatoire de l'intestin (MII) et du cancer colorectal (CRC). Il y a plus de 200 gènes de susceptibilité IBD, et des mutations dans plusieurs de ces gènes sont associés à la composition microbienne altérée dans l'intestin. Il est d'une grande importance clinique pour déterminer le mécanisme précis par lequel les gènes IBD-sensibilité régulent microbiote intestinale. L'objectif global de cette méthode est d'introduire un protocole de base de culture ex vivo d'organes du côlon et de démontrer comment cette méthode de culture peut être utilisée pour étudier les réponses antimicrobiennes de l'intestin de défense de l' hôte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les cellules épithéliales intestinales sont très sensibles en termes de leurs besoins de croissance et donc difficile à la culture. Les cellules épithéliales isolées par traitement à l' EDTA ne survivent pas dans un milieu de culture cellulaire classiques tels que le DMEM 8. Par conséquent, les études d'interaction hôte-pathogène en utilisant crypt isolées ou les cellules épithéliales primaires sont très difficiles. Récemment, Sato et al. décrit un système de culture or…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par un financement de la maladie de Crohn et la colite Foundation of America, (CCFA; 3711) la prévention du cancer et de l'Institut de recherche du Texas (CPRIT; RP160169) et UT Southwestern Medical Center donnés à MHZ
Materials
| Advanced DMEM/ F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride | Sigma | 5634 | |
| FBS, heat inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| Mouse IL-1b recombinan | Reprokine | RKP10749 | |
| Mouse IL-18 recombinant | Reprokine | RKP70380 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Difco Luria-Bertani Broth | BD Bioscience | 244620 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar | Fisher Scientific | DF0075-17-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Uded to measure RNA concentration | |
| UV/Vis Spectrophotometer | BECKMAN | DU 530 | Used to determine E. coli count |
| iScript RT Supermix, 100 rxns | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Univer SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | |
| Lysing Matrix S (1/8"), 2 mL Tube | MP Biomedicals | 116925500 | Used to homgenize colon organ for RNA isolation |
| FastPrep-24 5G System | Bio-Rad | 116005500 | |
| 100×15 Petri Dish | Falcon | 5687 | |
| Plate 6well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile | Cellstar | 5085 | |
| 100 micron cell strainer | Falcon | 5698 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sorvall ST40R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Forma Scientific orbital shaker | Thermo Fisher Scientific |
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