los<em> Ex Vivo</em> Colon Organo cultura y su uso en estudios de defensa antimicrobiana de host
Summary
The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.
Abstract
El intestino muestra una arquitectura de cripta estructuras repetitivas que consisten en diferentes tipos de células epiteliales, lámina propia que contiene células del sistema inmune, y el estroma. Todas estas células heterogéneas contribuyen a la homeostasis intestinal y participar en la defensa del huésped antimicrobiana. Por lo tanto, la identificación de un modelo sustituto para el estudio de la respuesta inmune y la actividad antimicrobiana del intestino en un entorno in vitro es extremadamente difícil. Los estudios in vitro con líneas de células epiteliales intestinales inmortalizadas o incluso cripta primaria organoid cultura no representan la fisiología exacta del intestino normal y su microambiente. Aquí, se discute un método de tejido de colon cultivo ratón en una placa de cultivo y cómo este ex vivo sistema de cultivo de órganos se puede implementar en estudios relacionados con las respuestas de defensa del huésped antimicrobianos. En experimentos representativos, se demostró que dos puntos en cultivo de órganos expresan péptidos antimicrobianos en respOnse a exógenos IL-1β y IL-18. Además, las moléculas efectoras antimicrobianos producidos por los tejidos de colon en el cultivo de órganos matan eficientemente Escherichia coli in vitro. Este enfoque, por lo tanto, puede ser utilizado para diseccionar el papel de patrones moleculares de patógenos y asociado de peligros y sus receptores celulares en la regulación de la respuesta inmune innata intestinales y las respuestas de defensa del huésped antimicrobianos.
Introduction
El intestino representa un sistema dinámico que actúa como una barrera para los microorganismos comensales, lucha contra los patógenos invasores, y regula la composición microbiana 1. Las células epiteliales intestinales, que consta de los enterocitos, células caliciformes, células de Paneth y células enteroendocrinas, son las principales poblaciones de células que proporcionan las respuestas de defensa del huésped contra microbiota intestinal. Las células caliciformes producen mucinas que crean una zona desmilitarizada en la parte superior de la capa epitelial 2. Las células de Paneth y enterocitos producen péptidos antimicrobianos, citoquinas, y las especies de oxígeno y nitrógeno reactivos que constituyen las respuestas de defensa del huésped antimicrobianos y contribuyen a la formación de la composición microbiana intestinal 3, 4. Además de las células epiteliales, las células inmunes incluyendo macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, células asesinas naturales, linfocitos y inna células linfoides de TE en la lámina propia y la submucosa juegan un papel crítico en las respuestas de defensa del huésped antimicrobianos intestinales por citoquinas que producen, quimiocinas, y otros mediadores de 5 – 7. Con el fin de entender cómo el sistema inmune de la mucosa regula microbiota y proporciona protección contra la infección microbiana, es importante tener en cuenta la compleja interacción de las poblaciones de células heterogéneas de la tripa. Sin embargo, un modelo in vitro que abarca todas las características del intestino no está disponible. Por lo tanto, los estudios moleculares en la interacción huésped-patógeno en el intestino son muy desafiante.
En los últimos años, varios sistemas de modelos que imitan aspectos de la mucosa intestinal han sido desarrollados para la investigación de los procesos fisiopatológicos implicados en las enfermedades inflamatorias del intestino (IBD) y otros trastornos gastrointestinales 8 –= "xref"> 14. líneas de células epiteliales intestinales inmortalizadas son a menudo utilizados para estudiar las respuestas específicas de células epiteliales. Sin embargo, debido a la expresión diferencial de genes y la función en las células inmortalizadas, los datos obtenidos del uso de esas células no suelen coincidir con los observados en los estudios in vivo. Cripta intestinal organoid cultura recientemente ha surgido como una herramienta potencial para la evaluación de la respuesta del epitelio intestinal a diferentes estímulos 13. En este sistema, se permitió que las células madre de la cripta para crecer y desarrollar una estructura organoid 3D. Mientras que el sistema de cultivo organoide es muy útil para el estudio de muchos aspectos del epitelio intestinal, que no imita la compleja interacción de las células inmunes, células epiteliales y productos microbianos. El cultivo ex vivo del tejido intestinal ofrece una mejor representación de las respuestas de defensa en vivo de acogida. En este método, una parte del intestino se cultiva en una placa de cultivo celular ingenioh medios adecuados que permitan a los diferentes tipos de poblaciones de células en el intestino para ser metabólicamente activo durante al menos 48 h. Por lo tanto, un cultivo ex vivo del órgano se puede utilizar para medir la expresión de genes antimicrobianos y las respuestas de defensa del huésped del intestino a un estímulo particular.
Los investigadores han estado utilizando el sistema de cultivo de órganos ex vivo para estudiar las respuestas de defensa del huésped frente a la infección microbiana en el intestino 15 de – 21 años. Recientemente hemos adoptado el sistema de cultivo de órganos para estudiar el papel de la inflamasoma en las respuestas de defensa del huésped antimicrobianos en colones de ratones 22. El inflamasoma es una plataforma molecular para la activación de la caspasa-1, que se requiere para la producción de IL-1β madura y IL-18. Hemos demostrado que la IL-1β e IL-18 inducen péptidos antimicrobianos que matan con eficacia pathobionts comensales tales como E. coli </em>. Esta observación fue consistente con el aumento de la carga de E. coli en colones de ratones inflamosoma-22 defectuosa. Este sistema, por lo tanto se puede utilizar para estudiar el papel de los receptores de reconocimiento de patrones (PRRS) y otras moléculas inmunes innatas en las respuestas de defensa del huésped antimicrobianos intestinales, así como la patogénesis de los trastornos intestinales tales como la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) y el cáncer colorrectal (CRC). Hay más de 200 genes de susceptibilidad IBD, y mutaciones en muchos de estos genes están asociados con la composición microbiana alterada en el intestino. Es de gran importancia clínica para determinar el mecanismo preciso por el que los genes de susceptibilidad IBD-regulan microbiota intestinal. El objetivo general de este método es introducir un protocolo básico de ex vivo de cultivo de órganos de colon y demostrar cómo este método de cultivo se puede utilizar para estudiar las respuestas de defensa del huésped antimicrobianos del intestino.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las células epiteliales intestinales son muy sensibles en cuanto a sus necesidades de crecimiento y por lo tanto difíciles de cultivar. Las células epiteliales aisladas por tratamiento con EDTA no sobreviven en medios de cultivo celular convencionales, tales como DMEM 8. Por lo tanto, huésped-patógeno estudios de interacción utilizando cripta aislado o células epiteliales primarias son muy difíciles. Recientemente, Sato et al. se describe un sistema de cultivo organoid cripta, que es muy …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos de la enfermedad de Crohn y Colitis Foundation of America, (CCFA; 3711) Prevención del Cáncer y el Instituto de Investigación de Texas (CPRIT; RP160169), y UT Southwestern Medical Center dan a MHZ
Materials
| Advanced DMEM/ F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride | Sigma | 5634 | |
| FBS, heat inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| Mouse IL-1b recombinan | Reprokine | RKP10749 | |
| Mouse IL-18 recombinant | Reprokine | RKP70380 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Difco Luria-Bertani Broth | BD Bioscience | 244620 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar | Fisher Scientific | DF0075-17-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Uded to measure RNA concentration | |
| UV/Vis Spectrophotometer | BECKMAN | DU 530 | Used to determine E. coli count |
| iScript RT Supermix, 100 rxns | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Univer SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | |
| Lysing Matrix S (1/8"), 2 mL Tube | MP Biomedicals | 116925500 | Used to homgenize colon organ for RNA isolation |
| FastPrep-24 5G System | Bio-Rad | 116005500 | |
| 100×15 Petri Dish | Falcon | 5687 | |
| Plate 6well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile | Cellstar | 5085 | |
| 100 micron cell strainer | Falcon | 5698 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sorvall ST40R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Forma Scientific orbital shaker | Thermo Fisher Scientific |
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