Rekonstituering af nucleosomer med differentielt isotopmærkede Sister Histoner
Summary
Denne protokol beskriver rekonstituering af nukleosomer indeholder differentielt isotopmærkede søster histoner. Samtidig kan asymmetrisk posttranslationelt modificerede nukleosomer genereres efter anvendelse af en premodified histon kopi. Disse præparater kan let anvendes til at studere modifikation krydstale mekanismer, samtidigt på begge søster histoner, ved hjælp af høj opløsning NMR-spektroskopi.
Abstract
Asymmetrisk modificerede nukleosomer indeholder to kopier af et histon (søster histoner) dekoreret med forskellige sæt post-translationelle modifikationer (PTMS). De er nyligt identificerede arter med ukendte midler til etablering og funktionelle konsekvenser. Aktuelle analysemetoder er utilstrækkelige til at påvise kopi-specifikke forekomst af PTMS på nukleosomale søster histoner. Denne protokol udgør en biokemisk fremgangsmåde til in vitro rekonstitution af nukleosomer indeholdende differentielt isotopmærkede søster histoner. Den genererede komplekset kan være også asymmetrisk modificeres efter herunder en premodified histon pulje under refoldning af histon subcomplexes. Disse asymmetriske nucleosomstørrelse præparater let kan reageret med histon-modificerende enzymer til at studere modifikation cross-talk mekanismer pålagt af asymmetrisk forhånd indarbejdet PTM hjælp kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Især angår modifikationsreaktioner irealtid kan kortlægges uafhængigt på de to søster histoner ved at udføre forskellige typer af NMR-korrelations- eksperimenter, skræddersyet til den respektive isotop type. Denne metode giver mulighed for at studere krydstale mekanismer, der bidrager til dannelsen og udbredelsen af asymmetriske PTM mønstre på nukleosomale komplekser.
Introduction
Eukaryot DNA er stramt pakket i cellekerner i kromatin. Den grundlæggende byggesten i kromatin er nukleosom kernepartikel, der indeholder ~ 147 bp af DNA viklet omkring en octamere kompleks bestående af to kopier af hver af de fire centrale histoner (H3, H4, H2A, H2B). Histonproteiner huser et væld af post-translationelle modifikationer (PTMS). Disse kovalente udskiftninger medføre forandringer i kromatin struktur, både direkte ved at påvirke den fysiske kemi af systemet og indirekte ved at rekruttere kromatin-remodeling aktiviteter 1, 2, 3. Med disse midler, histon PTMS styrer kromatin tilgængelighed og dermed regulere alle DNA-baserede cellulære funktioner 4.
PTMS installeres af histon-modificerende enzymsystemer hovedsageligt på de ustrukturerede N-terminale segmenter (haler) af nukleosom-inkorporeret kerne histoian. På grund af de mange modifikationssteder på forholdsvis kort sekvens af histon haler, PTMS påvirker hinanden ved at inducere eller blokering efterfølgende modifikationsreaktioner, en virkning, der kaldes modifikation krydstale 5. På grund af den samlede symmetriske arkitektur af nukleosom blev modifikationsreaktioner og krydstale mekanismer menes at opstå tilsvarende til de to kopier af hver nukleosomal histon (søster histoner). Dette koncept blev for nylig udfordret og efterfølgende modbevist. Især in vitro-enzymatiske assays på fri histon H3 hale peptider og på nukleosomer viste, at et sæt H3 kinaser indført fosforylering i en asymmetrisk måde 6. Derudover affinitet-oprensning-baserede LC-MS / MS-analyse afslørede tilstedeværelsen af asymmetrisk H3-methyleret nukleosomer i flere typer af eukaryote celler 7. Således asymmetrisk modificerede nukleosomer udgør hidtil ukendte arter, ogværktøjer er nødvendige for at afdække de mekanismer, der styrer deres dannelse og til at analysere krydstale effekter, som denne asymmetri kan udøve.
Sædvanligvis har Western Blotting (WB) og massespektrometri (MS) analyse blevet anvendt til at detektere histon PTMS. På trods af sin nem anvendelse, WB lider specificitet / krydsreaktivitet problemer. Oven i det, er det ude af stand til at udføre samtidige multi-PTM analyse og direkte kvantificering af modifikationen reaktioner 8. På den anden side, MS-analyse anvender sofistikeret instrumentering, der kræver uddannelse på højt niveau, men giver høj specificitet samt samtidig kortlægning og kvantificering af multiple PTMS 9. Men begge metoder er forstyrrende og nukleosomale komplekser dissocieres før analyse, hvilket giver anledning til en blanding af histoner og / eller histon-afledte peptider. Denne manipulation fjerner evnen til at skelne uafhængigemodifikation reaktioner, der forekommer på hver af de to søster histoner og at rapportere kopien-specifikke modifikation status nukleosomale histoner.
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spektroskopi udviklet sig som en alternativ metode til kort PTM reaktioner. NMR er uforstyrret og tillader således overvågning af PTM begivenheder i en real-time måde i rekonstituerede blandinger, og selv i intakte celler 10, 11. Udviklingen af rutiner til hurtig dataindsamlings- og for høj opløsning kortlægning baseret på 2D hetero-nuklear sammenligningstabeller metoder til isotopmærkede (15N og / eller 13C) prøver 12 tillod den samtidige kortlægning af forskellige typer PTMS, såsom som serin / threonin / tyrosinphosphorylering, lysin acetylering / methylering og arginin methylering 13. Afhængigt af PTM under undersøgelsen, 15 N- eller 13C-mærkning protocols kan anvendes til at markere det protein funktionel gruppe, der fungerer som en modifikation reporter. Følgelig kan PTM kortlægning udføres ved at følge den karakteristiske kemiske skift forskydning af den tilsvarende funktionelle gruppe "sensing" ændringen på det kemiske miljø. I de fleste tilfælde kan både NH og CH kemiske grupper anvendes til at rapportere udviklingen i PTM af interesse.
Den nuværende protokol beskriver generation af nukleosomer indeholder differentielt isotopmærkede søster histoner. Den kombinerer fleksibiliteten af NMR-spektroskopi til kort PTMS anvendelse af både 1 H- 15 N og 1H-13C korrelationsspektre med udnyttelsen af forskellige protein affinitetsmærker til oprensning af de udvalgte rekonstituerede histon-komplekser. Især protokollen anvender to forskellige puljer af en bestemt histon for nukleosom rekonstituering. Disse puljer er differentielt isotop-mærket (et med <sup> 15 N, den anden med 13 C), og de er fusioneret til en polyhistidin og et streptavidin affinitetsmærke hhv. En tandem oprensningssystem affinitet med Ni-NTA og streptavidin-baseret kromatografi oprindeligt anvendt af Voigt et al. 7 anvendes til at oprense asymmetrisk arter fra symmetriske modstykker (figur 1A). Asymmetrisk histon oktamerer bruges efterfølgende at rekonstruere tilsvarende nukleosomale komplekser (figur 1B), ved hjælp af standard salt dialyse metode 14. Derudover gennem den samme procedure, og ved at have en af histon puljer pre-modificerede, et PTM kan inkorporeres asymmetrisk på de resulterende nukleosomer. Reaktionen af disse substrater med histon-modificerende enzymer og efterfølgende NMR-kortlægning af modifikation begivenheder muliggøre karakterisering af krydstale mekanismer både i-cis (premodified histon kopi) og i-trans (unmodified histon kopi) (figur 1C).
Protocol
Representative Results
Discussion
For nukleosom rekonstitution den nuværende protokol anvender en 165 bp lang DNA-skabelon, der indeholder 601-Widom nukleosom positionering sekvens 20, men lignende ydeevne forventes ved hjælp af forskellige længder af DNA-skabeloner. Protokollen er designet og ansat ved hjælp af asymmetriske former for histon H3. Med det samme princip, kan metoden også anvendes for de øvrige centrale histoner og derudover kan bruges til at rekonstituere komplekser bærer to forskellige centrale histoner med…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatteren takker Dr. Philipp Selenko (FMP-Berlin) for at levere wet-lab plads og infrastruktur til at udføre eksperimenter og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) til finansiering af arbejde gennem en forskningsbevilling (LI 2402 / 2-1).
Materials
| Unfolding Buffer | 7M guanidinium HCl | ||
| 20mM Tris pH7.5 | |||
| 10mM DTT | |||
| Refolding Buffer | 10mM Tris pH7.5 | ||
| 2M NaCl | |||
| 1mM EDTA | |||
| 2mM DTT | |||
| Assay Buffer | 25mM NaxHxPO4 pH6.8 | ||
| 25mM NaCl | |||
| 2mM DTT | |||
| Guanidinium HCl | Applichem | A14199 | Use high quality Gu-HCl |
| Tris | Roth | 4855.2 | |
| DTT | Applichem | A1101 | |
| NaCl | VWR chemicals | 27810.364 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Na2HPO4 | Applichem | A1046 | |
| NaH2PO4 | Applichem | A3902 | |
| Imidazole | Applichem | A1073 | |
| d-Desthiobiotin | Sigma | D1411 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 1034557 | |
| Strep-Tactin Superflow | IBA | 2-1207-001 | |
| His-probe antibody | Santa Cruz | sc-8036 | |
| Strep-tactin conjugated HRP | IBA | 2-1502-001 | |
| Hi-Load 16/600 Superdex 200pg | GE Healthcare | 28-9893-35 | |
| 6-8kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 1, 132650 | |
| 50kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 7, 132129 | |
| 10kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC901024 | |
| 30kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC903024 | |
| Solution-state NMR spectrometer | at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe |
References
- Hansen, J. C. Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The Biology of Chromatin Remodeling Complexes. Annu. Rev. Biochem. 78, 273-304 (2009).
- Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications. Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The Language of Histone Crosstalk. Cell. 142 (5), 682-685 (2010).
- Liokatis, S., et al. Phosphorylation of histone H3 Ser10 establishes a hierarchy for subsequent intramolecular modification events. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (8), 819-823 (2012).
- Voigt, P., et al. Asymmetrically Modified Nucleosomes. Cell. 151 (1), 181-193 (2012).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications. Chem. Rev. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Liokatis, S., Dose, A., Schwarzer, D., Selenko, P. Simultaneous Detection, of Protein Phosphorylation and Acetylation by High-Resolution NMR Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 132 (42), 14704-14705 (2010).
- Binolfi, A., et al. Intracellular repair of oxidation-damaged α-synuclein fails to target C-terminal modification sites. Nat. Commun. 7, 10251 (2016).
- Schanda, P., Kupce, E., Brutscher, B. SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds. J. Biomol. NMR. 33 (4), 199-211 (2005).
- Theillet, F. X., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of Nucleosome Core Particles from Recombinant Histones and DNA. Methods Enzymol. 375, 23-43 (2004).
- Artimo, P., et al. ExPASy :SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40 (W1), 597-603 (2012).
- Liokatis, S., klingberg, R., Tan, S., Schwarzer, D. Differentially Isotope-Labeled Nucleosomes to Study Asymmetric Histone Modification Crosstalk by Time-Resolved NMR Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (29), 8262-8265 (2016).
- Stützer, A., et al. Modulations of DNA Contacts by Linker Histones and Post-translational Modifications Determine the Mobility and Modifiability of Nucleosomal H3 Tails. Mol. Cell. 61 (2), 247-259 (2016).
- Zhou, B. R., et al. Histone H4 K16Q Mutation, an Acetylation Mimic, Causes Structural Disorder of Its N-terminal Basic Patch in the Nucleosome. J. Mol. Biol. 421 (1), 30-37 (2012).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), 19-42 (1998).
- Hackenberger, C. P., Schwarzer, D. Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (52), 10030-10074 (2008).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific mapping and time-resolved monitoring of lysine methylation by high-resolution NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7616-7619 (2012).
- Lechner, C. C., Agashe, N. D., Fierz, B. Traceless Synthesis of Asymmetrically Modified Bivalent Nucleosomes. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (8), 2903-2906 (2016).
- Bernstein, B. E., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125 (2), 315-326 (2006).
