La piattaforma BIOWIRE cardiaco è un metodo in vitro utilizzato per maturare embrionale umano e cardiomiociti derivati dalle cellule staminali pluripotenti indotte (HPSC-CM) combinando coltura cellulare tridimensionale con stimolazione elettrica. Questo manoscritto presenta la configurazione dettagliata della piattaforma BIOWIRE cardiaco.
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Articolo metodologico
Maturazione di staminali umane cardiomiociti derivati dalle cellule in Biowires Utilizzando Stimolazione Elettrica
In questo articolo
Sommario
Abstract
cardiomiociti derivati dalle cellule staminali umane pluripotenti (HPSC-CMS) sono stati una fonte di cellule promettente e hanno così favorito l'esame delle loro potenziali applicazioni nel campo della ricerca cardiaca, tra cui la scoperta di farmaci, la modellazione della malattia, l'ingegneria dei tessuti e della medicina rigenerativa. Tuttavia, le cellule prodotte da protocolli esistenti mostrano una serie di immaturità rispetto ai cardiomiociti adulti ventricolare nativi. Molti sforzi sono stati fatti maturare HPSC-CM, con solo la maturazione moderata raggiunto finora. Pertanto, un sistema ingegnerizzato, chiamato BIOWIRE, è stato ideato prevedendo stimoli fisici ed elettrici di condurre HPSC-CM ad uno stato più maturo in vitro. Il sistema utilizza una piattaforma microfabbricazione per seminare HPSC-CM in collagene tipo I gel lungo un modello di sutura rigido da montare nel tessuto cardiaco allineata (BIOWIRE), sottoposto alla stimolazione campo elettrico con una frequenza progressivamente crescente. Rispetto ai controlli non stimolate,stimolati biowired cardiomiociti presentano un maggiore grado di maturazione strutturale ed elettrofisiologico. Tali cambiamenti dipendono dalla frequenza di stimolazione. Questo manoscritto descrive in dettaglio la progettazione e realizzazione di biowires.
Introduzione
La terapia a base di cellule è una delle strategie più promettenti e studiati per raggiungere cardiaca riparazione / rigenerazione. E 'stato aiutato da ingegneria dei tessuti cardiaco e il co-fornitura di biomateriali 1, 2. La maggior parte delle fonti di cellule disponibili sono stati studiati in modelli animali per i loro effetti potenzialmente benefici sulla danneggiati, malati, o cuori di età compresa tra 3. In particolare, notevoli sforzi sono stati fatti per usare cellule staminali pluripotenti umane (HPSC) -derived cardiomiociti (HPSC-CM), una fonte di cellule autologhe pote....
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Protocollo
1. master e Fabrication
Nota: utilizzare litografia soft per la fabbricazione di dispositivi. Fare un doppio strato SU-8 master per polidimetilsilossano (PDMS) stampaggio.
- Progettare il dispositivo utilizzando un design e redazione software (Figura 1A, sinistra). Disegnare ogni strato del maestro separatamente. Stampa il design del dispositivo su due fotomaschere a 20.000 dpi, corrispondenti ai due strati del maestro 15. Impostare il modello dispositivo trasparente e la zona circostante scura; le maschere serviranno da modello per trasferire il disegno otticamente dispositivo sul SU-8 me....
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Risultati
Il razionale per l'uso di una sutura nelle biowires è servire come stampo per la formazione di costrutti 3D che si allineano in un asse e imitano la forma di fibre cardiache. Abbiamo dimostrato che dopo sette giorni di coltura in BIOWIRE, cellule rimodellato il gel intorno la sutura (Figura 3A). Le celle assemblate lungo l'asse della sutura per formare in linea di tessuto cardiaco (Figura 3). Dopo 7 giorni di precoltura, i biowires sono stati sot.......
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Discussione
Questo manoscritto descrive la configurazione e implementazione della piattaforma progettata, BIOWIRE, per migliorare la maturazione di HPSC-CM. Il dispositivo può essere realizzato in impianti di microfabbricazione standard e biowires può essere prodotto con tecniche di coltura cellulare comuni e uno stimolatore elettrico.
A nostra conoscenza, non esiste un metodo simile a quello riportato biowires. Questa strategia rivela che il miglioramento delle proprietà di maturazione sono dipendenti .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione-in-aiuto del Heart and Stroke Foundation of Canada (G-14-0.006.265), sovvenzioni di funzionamento dal Canadian Institutes of Health Research (137.352 e 143.066), e una borsa di studio fondazione JP Bickell (1.013.821 ) al SSN.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido L-ascorbico | Sigma | A-4544 | hPSC-CM terreno di coltura componente |
| AutoCAD | Autodesk, Inc | Software per la progettazione del dispositivo | |
| Barre di carbonio, Ø 3 mm | Componente della camera di stimolazione elettrica | ||
| Collagene, tipo 1, coda di topo | BD Biosciences | 354249 | Gel di collagene: 2,1 mg/mL di collagene di coda di ratto di tipo I in 24,9 mM di glucosio, 23,8 mM di NaHCO3, 14,3 mM di NaOH, 10 mM di HEPES, in 1 terreno M199 con il 10% di Matrigel ridotto del fattore di crescita. |
| Collagenasi di tipo I | Sigma | C0130 | 0,2% collagenasi tipo I (p/v) e 20% FBS (v/v) in PBS con Ca2+ e Mg2+. Sterilizzare con 0,22 μ m e fare aliquote da 12 mL. Conservare a -20 °C. |
| Deossiribonucleasi I (DNasi I) | EMD Millipore | 260913-25MU | Produrre 1 mg/mL di DNasi I soluzione madre in acqua. Filtrare in modo sterile e conservare aliquote da 0,5 mL a &meno; 20 ° C |
| Trapano e punte (Ø 1 mm e 2 mm) | Dremel | Fori nei telai in policarbonato | |
| Stimolatore elettrico | Erba | s88x | |
| Siero fetale bovino (FBS) | WISENT Inc. | 080-450 | |
| D-(+)-Glucosio | Sigma | G5767 | Componente in gel di collagene |
| L-Glutammina | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| H2O | MilliQ | 18.2 MΩ &punto medio; cm a 25 gradi C, ultrapuro, per rendere tutte le soluzioni | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Componente in gel di collagene |
| Piastra riscaldante | Torrey Pines | HS40 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| Allineatore per maschera | EVG | EVG 620 | |
| Matrigel, fattore di crescita ridotto | Corning | 354230 | Componente in gel di collagene |
| Medium 199 (M199) | Thermo Fisher Scientific | 11825015 | Componente in gel di collagene |
| Monotioglicerolo (MTG) | Sigma | M-6145 | hPSC-CM |
| Agitatore orbitale | VWR | 89032-088 | |
| Penicillina/Streptomicina (P/S) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con Ca2+ e Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| Piastra (6 pozzetti) | Piastra | Corning 353046 | |
| (6 pozzetti), attacco basso | Fili di platino Corning | 3471 | |
| , 0,2 mm | Componente della camera dello stimolatore elettrico | ||
| Polidimetilsilossano (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glicole propilenico monometil etere acetato (PGMEA) | Doe & Ingalls Inc. | Per sviluppare la busta per wafer | |
| , convertitori a strappo | 92308 | per la sterilizzazione a vapore | |
| Wafer di silicone, 4 pollici | UniversityWafer Inc. | ||
| Bicarbonato di sodio (NaHCO3)Sigma | S5761 | Componente in gel di collagene | |
| Idrossido di sodio | Sigma | S8045 | Componente in gel di collagene |
| Sprin coater | Sistemi di rivestimento speciali | G3P-8 | |
| StemPro-34 terreno di coltura | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | Terreno di coltura hPSC-CM. Per fare 50 ml, aggiungere 1,3 ml di supplemento, 500 μ L di 100&volte; L-Glutammina, 250 μ L di 30 mg/mL di transferrina, 500 μ l di 5 mg/mL di acido ascorbico, 150 μ L di 26 μ l /2 mL di monotioglicerolo (MTG) e 500 μ L (1 %) penicillina/streptomicina. |
| di arresto | : FBS (1:1) | ||
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | fotoresist, componente principale | |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | fotoresist, componente principale | |
| Transferrina | Roche | 10-652-202 | hPSC-CM terreno di coltura |
| composto Tripsina/EDTA, 0,25% | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | hPSC-CM terreno di coltura composto |
| Terreno | IMDM contenente l'1% di penicillina/streptomicina |
Riferimenti
- Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005(2015).
- Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and t....
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Ristampe e permessi
