Summary

Созревание стволовых клеток человека, полученных кардиомиоцитов в Biowires Использование электрической стимуляции

Published: May 06, 2017
doi:

Summary

Сердца biowire платформа является методом в пробирке используется для зрелых человеческих эмбриональных и индуцированных клеток , полученных кардиомиоцитов плюрипотентных стволовых (HPSC-CM) путем объединения трехмерного культивирования клеток с электрической стимуляцией. Эта рукопись представляет подробную установку сердечной biowire платформы.

Abstract

Человека плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоциты (HPSC-КМВ) был многообещающим источником клеток и таким образом поощрять исследование их потенциальных применений в сердечной исследований, в том числе открытия новых лекарств, моделирование болезни, тканевой инженерии и регенеративной медицины. Однако, клетки, полученные существующими протоколами показывают диапазон незрелости по сравнению с носителями взрослых желудочковых кардиомиоцитов. Много усилий было сделано, чтобы созреть HPSC-КМВ, с умеренным созревании достиг до сих пор. Таким образом, разработано система, названная biowire, была разработана путем предоставления как физические и электрических сигналов , чтобы привести HPSC-CMs к более зрелому состоянию в пробирке. Система использует платформу микроизготовленной семени HPSC-CMs в коллагене типа I гелеобразованию вдоль жесткого шаблона шовного материала, чтобы собрать в выровненную ткань сердца (biowire), который подвергается воздействию электрического поля стимуляции с постепенно возрастающей частотой. По сравнению с нестимулированным управлением,стимулировал biowired кардиомиоцитов проявляют повышенную степень структурного и электрофизиологического созревания. Такие изменения зависят от скорости стимуляции. Эта рукопись подробно описывает конструкцию и создание biowires.

Introduction

Клеточная терапия является одним из наиболее перспективных и исследуемых стратегий для достижения сердца ремонта / восстановления. Это было облегчено инженерии сердечной ткани и совместной доставки биоматериалов 1, 2. Большинство доступных источников клеток, были изучены на животных моделях для их потенциально благотворное воздействие на поврежденные, больные, или престарелыми сердца 3. В частности, значительные усилия были предприняты, чтобы использовать человеческие плюрипотентные стволовые клетки (HPSC) -derived кардиомиоцитов (HPSC-CM), потенциально неограниченный источник аутологичных клеток для инженерии сердечной ткани. HPSC-МС может быть получен с использованием нескольких установленных протоколов 4, 5, 6. Однако полученные клетки обладают эмбриональными-подобными фенотипами, с диапазоном незрелых характеристик по сравнению со взрослыми желудочковых кардиомиоцитов 7, </sup> 8. Это может быть препятствием для применения HPSC-CMs в качестве моделей взрослой ткани сердца в исследовании обнаружения наркотиков и в развитии взрослых сердечных моделей заболеваний 9.

Для того, чтобы преодолеть это ограничение фенотипической незрелости, новые подходы активно исследуются в целях содействия кардиомиоцитов созреванию. Ранние исследования показали , эффективные свойства про-созревания в неонатальных кардиомиоцитов крыс с помощью циклического механического 10 или электрической стимуляции 11. Гель для уплотнения и циклическое механическое раздражение также показали , чтобы улучшить некоторые аспекты HPSC-CM созревания 12, 13, с минимальным усилением электрофизиологических и кальцием свойств обработки. Таким образом, система платформы называется «биологическая провод» (biowire) была разработана путем предоставления как структурных сигналов и электрическое поле stimulatioп для повышения созревания HPSC-МС 14. Эта система использует микроизготовленную платформу для создания выровненной сердечной ткани, которая поддается электрической стимуляция поля. Это может быть использовано для улучшения структурных и электрофизиологические зрелостей HPSC-CMs. Здесь мы описываем деталь изготовления такого biowires.

Protocol

1. Мастер Дизайн и изготовление Примечание: Используйте мягкую литографию для изготовления устройства. Сделать двухслойные мастер в SU-8 для полидиметилсилоксана (PDMS) под давление. Конструкция устройства с помощью проектирования и черчения программного обеспечени…

Representative Results

Рациональное для использования шовного материала в biowires, чтобы служить в качестве шаблона для формирования 3D-конструкций, которые выравнивают на одной оси, и имитируют форму сердечных волокон. Показано , что после семи дней культивирования в biowire, клетка перестроенно?…

Discussion

Эта рукопись описывает установку и внедрение спроектированной платформы, biowire, чтобы улучшить созревание HPSC-CMs. Устройство может быть выполнено в стандартных объектах микрообработки, и biowires может быть получен с обычными методами клеточной культуры и электрическим стимулятором.

<p clas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантом-в-помощь от сердца и инсульта Фонда Канады (G-14-0006265), операционные гранты от Канадского института исследований в области здравоохранения (137352 и 143066) и грантом фонда Джп Бикелл (1013821 ) к ССН.

Materials

L-Ascorbic acid Sigma A-4544 hPSC-CM culture media componet
AutoCAD Autodesk, Inc Software to design device
Carbon rods, Ø 3 mm Electrical stimulator chamber component
Collagen, type 1, rat tail BD Biosciences 354249 Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel.
Collagenase type I  Sigma C0130 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C.
Deoxyribonuclease I (DNase I) EMD Millipore 260913-25MU Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C
Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm) Dremel Drill holes in polycarbonate frames
Electrical stimulator Grass s88x
Fetal bovine serum (FBS) WISENT Inc. 080-450
D-(+)-Glucose  Sigma G5767 Collagen gel component
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
H2O MilliQ 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions
HEPES Sigma H4034 Collagen gel component
Hot plate Torrey Pines HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440053
Mask aligner EVG  EVG 620
Matrigel, growth factor reduced  Corning 354230 Collagen gel component
Medium 199 (M199) Thermo Fisher Scientific 11150059 Collagen gel component
Monothioglycerol (MTG) Sigma M-6145 hPSC-CM culture media componet
Orbital shaker VWR 89032-088
Penicillin/Streptomycin (P/S) Thermo Fisher Scientific 15070063
Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+  Thermo Fisher Scientific 14040133
Plate (6-well) Corning 353046
Plate (6-well), low attachment Corning 3471
Platinum wires, 0.2 mm Electrical stimulator chamber component
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) Doe & Ingalls Inc. To develop the wafer
Pouch, peel-open Convertors 92308 For steam sterilization
Silicon wafer, 4-inch UniversityWafer Inc.
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761 Collagen gel component
Sodium hydroxide Sigma S8045 Collagen gel component
Sprin coater Specialty Coating Systems G3P-8
StemPro-34 culture medium Thermo Fisher Scientific 10639011 hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin.
Stop media  Wash medium:FBS (1:1)
SU-8 50  MicroChem Corp. photoresist, master component
SU-8 2050  MicroChem Corp. photoresist, master component
Transferrin Roche 10-652-202 hPSC-CM culture media componet
Trypsin/EDTA, 0.25% Thermo Fisher Scientific 25200056 hPSC-CM culture media componet
Wash medium IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin

References

  1. Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005 (2015).
  2. Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).
  3. Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84, 85-106 (2015).
  4. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).
  5. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  6. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  7. Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).
  8. Dolnikov, K., et al. Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction. Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).
  9. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
  10. Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).
  11. Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).
  12. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
  13. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).
  14. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  15. Lake, M., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
  16. Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).
  17. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
  18. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
  19. Radisic, M., et al. Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue. Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).
  20. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).

Play Video

Cite This Article
Sun, X., Nunes, S. S. Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (123), e55373, doi:10.3791/55373 (2017).

View Video