تبسيط خلية مفردة تكر العزلة وتوليد نواقل فيروسات النسخ العكسي في المختبر و في فيفو التعبير لتكرس البشرية
Summary
يجمع البروتوكول الحالي خلية مفردة إقران البشرية تكر ألفا وبيتا سلسلة التسلسل مع تبسيط جيل نواقل النسخ العكسي متوافقة مع التعبير تكر في المختبر و في فيفو .
Abstract
على الرغم من ذلك، تم تطوير العديد من الأساليب لتسلسل سلاسل ألفا وبيتا مستقبلات (تكر) إقران تي خلية من خلايا تي واحد، وحتى الآن لم يكن أي تفضي إلى المصب في فيفو التحليل الوظيفي تكر هيتيروديميرس. لقد وضعنا بروتوكولا محسنة استناداً خطوتين متداخلة متعدد بكر، الذي ينتج منتج PCR تمتد عبر مناطق متغير بأكملها من السلاسل البشرية تكر ألفا وبيتا. بتحديد مواقع قيود فريدة من نوعها وإدماجها في كبسولة تفجير بكر، قدمنا المنتج بكر متوافقة مع مباشرة دون استنساخ داخل قالب المتجهة للفيروسات الرجعية. بناء النسخ العكسي الناتجة بترميز تشيميريك الإنسان/ماوس تكر مع مجال ماوس داخل الخلايا، والتي وظيفية في الخلايا الماوس أو في فيفو نماذج الماوس. عموما، البروتوكول هو موضح هنا يجمع بين خلية بشرية واحدة إقران تكر ألفا وبيتا سلسلة الهوية مع الجيل مبسطة من نواقل فيروسات النسخ العكسي القابلة للتكييف وفقا لتعبير تكر في المختبر و في فيفو . الفيديو والمواد المصاحبة مصممة لإعطاء وصف مفصلة للغاية لخلية مفردة بكر، حتى تكون الخطوات الحاسمة المزالق المحتملة ويتبع تجنبها. بالإضافة إلى ذلك، نحن نقدم وصفاً مفصلاً لاستنساخ الخطوات الضرورية لإنشاء ناقل التعبير. وبمجرد أن يتقن، يمكن أداء الإجراء بأكمله من خلية مفردة الفرز للتعبير تكر في فترة أسبوعين قصيرة.
Introduction
ويملي مستقبلات خلية تي (تكر) خلية T مصير قرار أثناء وضع وحالة مستقرة/التوازن والتحفيز مستضدي في هامش1،،من23. التوسع الأخير في أعماق تسلسلها على تكنولوجيات كشفت عن تنوع تكر التقدير سابقا ضمن استجابات محددة T الخلية مستضد. التنوع تكر يوحي بإمكانية لاستجابات واسعة وظيفيا T الخلية. بغية إدماج تحليل مرجع تسلسل تكر مع الاختبارات الوظيفية تكر، نهج التسلسل ينبغي أن تصمم لتكون متوافقة مع النظم التجريبية و في فيفو النماذج المستخدمة لتحليل وظيفي اللاحقة لتحديد تكرس. ولدينا وضع نهج فعال لعزل تسلسل تكر البشرية وتبسيط الاستنساخ الفرعي في تشيميريك الإنسان/ماوس تكر ناقل قالب متوافق مع التعبير تكر في الفئران أنسنة هلا4. يتطلب عزلة سلاسل ألفا وبيتا المقابلة من هيتيروديميريك تكرس التضخيم بكر كلا سلاسل من خلية واحدة. وعلى الرغم من عدة بروتوكولات الاستنساخ تكر خلية واحدة تم تطويرها واستخدامها، حتى الآن لم بسهولة متوافق مع الفائق مبسطة مباشرة استنساخ غير معروف Vα/Vβ “تكرس” إلى نواقل فيروسات النسخ العكسي اللازمة لإعادة التعبير الحية 4،5،،من67. وقد استخدمت الدراسات السابقة نهجين رئيسيين، أما بشكل انتقائي تضخيم جزء محدود من تكر كافية لاستقراء التسلسل، أو لتضخيم أكمله تكر تسلسل4،5،6 , 7-التحليل الوظيفي المصب تكر تسلسلات التي تم الحصول عليها عن طريق النهج الأول يتطلب مكلفة في السيليكون الجمعية و حيثياته بناء تكر. بينما يوفر النهج الثاني تكر التسلسل الكامل، منطقة ثابتة البشرية غير متوافق مع التعبير في فيفو لتكرس المستنسخة في نماذج الماوس. نهجنا مصممة خصيصا لتكون متوافقة مع فيفو التحليل الوظيفي لتكرس في نماذج الماوس. قمنا بتطوير خلية واحدة فعالة ومبسطة [بكر] بروتوكول يسمح بمباشرة دون استنساخ PCR الشظايا في ناقلات التعبير قالب.
ويستخدم نهجنا حساسة للغاية متداخلة متعدد بكر رد فعل الذي يتم تنفيذه في خطوتين. في أول رد فعل متعدد خطوة تجمع 40 كبسولة تفجير محددة لجميع سلاسل بيتا الخامس وبركة 44 كبسولة تفجير محددة لكافة سلاسل ألفا الخامس تستخدم لتضخيم تكر-ألفا أو بيتا تكر دون علم مسبق بالتسلسل (الجدول 1). التمهيدي إلى الأمام بتسلسل محول، التي أدمجت في 5 ‘ المنتج PCR. وتستند التمهيدي عكس المنطقة المستمر من تكر. وقد حددنا مواقع القيود الفريدة التي غائبة عن متغير البشرية أو مناطق تقاطع تكر، وأدرجت هذه إلى إعادة تصميمها حديثا TCRα و TCRβ الإشعال (الشكل 1). في رد فعل متداخلة الثانية، تستخدم تمهيدي محددة لتسلسل محول وتمهيدي عكس متداخلة داخل المنطقة المستمر كذلك تضخيم سلاسل تكر مع زيادة خصوصية (الجدول 1، الشكل 1). بعد عزل خلية مفردة، تقريب اثنين من بكر (الرد الأول مع مجموعة الإشعال Vα و Vβ، والثانية مع محول الإشعال) يؤدي إلى منتج PCR التي يمكن أن تكون مباشرة دون استنساخ داخل قالب المتجهة للفيروسات الرجعية. سوف ترميز بناء تكر النهائية، في إطار واحد قراءة مفتوحة (ORF)، المناطق متغير البشرية جنبا إلى جنب مع المناطق الماوس ثابتة متصلة بواسطة تسلسل البروتين ‘كليافينج الذاتي’، P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. التسلسل P2A قد استخدمت في نظم متعددة، وقد تم اختبارها على نطاق واسع على وجه التحديد للتعبير عن تكرس8،9،،من1011. وعلى الرغم من بعد ترجمة معظم بقايا تسلسل P2A يعلق على ج-المحطة ألفا سلسلة متصلة بواسطة رابط مرنة، في حين تتابع الإشارات سلسلة بيتا برولين إضافية، هذا التعديل ليس له أي تأثير ضار على وظيفة تكر. يستخدم منطقة الماوس ثابتة في البناء بدلاً من الإنسان لتجنب التفاعلات المتغيرة المحتملة مع مكونات مما يشير إلى المصب عند إعادة المعرب عنها في الخلايا الماوس. ORF واحد سيؤدي إلى المقايسة التعبير منفصلة من ألفا وبيتا سلاسل9،11. البروتوكول الحالي يستند إلى الكواشف والنهج التي تتوفر على نطاق واسع، وهي مصممة على أن يتم بطريقة مبسطة وفعالة. على الرغم من أن التحديد أننا استخدمنا هذا الأسلوب للاعتداء تكرس من خلايا تي ذاتية التفاعل المتورطين في مرض السكري المناعة الذاتية، ونحن نتوقع أن هذا البروتوكول يمكن أن تطبق على نطاق واسع لتحديد وتقييم وظيفي محدد للبشرية تكرس المناعة الذاتية [ابيتوبس] أو [ابيتوبس] سرطان أو الردود على مسببات الأمراض واللقاحات.
Protocol
Representative Results
Discussion
في البروتوكول الحالي، يصف لنا طريقة فعالة لخلية مفردة تكر التضخيم واللاحقة دون استنساخ تكر إقران سلاسل ألفا وبيتا في ناقل للفيروسات التراجعية تعبير قالب. على الرغم من ذلك، وقد وضعت عدة بروتوكولات بكر خلية مفردة، وحتى الآن لم يكن أي متوافقة مع فورا دون استنساخ إلى متجه تعبير. في معظم الحال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذه الدراسة من JDRF 1-FAC-2014-243-A-N، أدا 7-14-جي-07، والمعاهد الوطنية للصحة 5 P30 DK079638-05 الطيار بيتاجول، وروبرت ومؤسسة ماكنير جانيس.
ونشكر ساندرا بينا وماكدونالد أندريني للتوظيف المريض، وصمويل بلوم للمساعدة التقنية، والدكتور جورج ماكيدوناس للهدية من الأجسام المضادة ومراقبة الحمض النووي يستخدم للتحسين PCR.
Materials
| CFSE | eBioscience | 65-0850-84 | 5 μM |
| anti-human CD4 (OKT4) BV421 | Biolegend | 317433 | 2 μg/mL |
| anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317336 | 2 μg/mL |
| anti-mouse CD3 AF647 | Biolegend | 100322 | 2.5 μg/mL |
| Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU | VWR | 97068-158 | 0.7 U |
| Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit | Invirtogen | 4368814 | 9 U (RT enzyme) |
| NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL | Invirtogen | AM9932 | |
| Gotaq DNA polymerase 2500U | VWR | PAM3008 | 1 U |
| 96 Well Half Skirt PCR Plate | Phenix | MPX-96M2 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | ThermoFisher | 4306311 | |
| UltraPure Agarose | Invirtogen | 15510-027 | |
| SnaBI | New England Biolabs | R0130 | 15 U (insert) 30 U (vector) |
| SacII | New England Biolabs | R0157 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| MfeI | New England Biolabs | R3589S | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| BstBI | New England Biolabs | R0519 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| Calf Intestinal Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | 10 U |
| Quick ligase | New England Biolabs | M2200S | |
| Wizard Plus minipreps DNA purification systems | Promega | A1460 | |
| Wizard Plus midipreps DNA purification systems | Promega | A7640 | |
| DNA clean & concentrator-25 kit | Genesee Scientific | 11-304C | |
| ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit | Genesee Scientific | 11-306A | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | ThermoFisher | 18265017 | |
| Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent) | Mirus | MIR2300 | |
| BD FACS Aria II (sorter) | BD | ||
| BD Fortessa (flow cytometer) | BD |
References
- Germain, R. N. T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision. Nat Rev Immunol. 2 (5), 309-322 (2002).
- Singer, A., Adoro, S., Park, J. H. Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice. Nat Rev Immunol. 8 (10), 788-801 (2008).
- Tubo, N. J., et al. Single naive CD4+ T cells from a diverse repertoire produce different effector cell types during infection. Cell. 153 (4), 785-796 (2013).
- Sprouse, M. L., et al. Rapid identification and expression of human TCRs in retrogenic mice. J Immunol Methods. , (2016).
- Lennon, G. P., et al. T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event. Immunity. 31 (4), 643-653 (2009).
- Dash, P., et al. Paired analysis of TCRalpha and TCRbeta chains at the single-cell level in mice. J Clin Invest. 121 (1), 288-295 (2011).
- Kobayashi, E., et al. A new cloning and expression system yields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancer within 10 days. Nat Med. 19 (11), 1542-1546 (2013).
- Szymczak, A. L., et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single ‘self-cleaving’ 2A peptide-based retroviral vector. Nat Biotechnol. 22 (5), 589-594 (2004).
- Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. T-cell receptor retrogenic mice: a rapid, flexible alternative to T-cell receptor transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
- Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3 (3), 191-197 (2006).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J Immunol Methods. 283 (1-2), 173-183 (2003).
- James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
- Corthay, A., Nandakumar, K. S., Holmdahl, R. Evaluation of the percentage of peripheral T cells with two different T cell receptor alpha-chains and of their potential role in autoimmunity. J Autoimmun. 16 (4), 423-429 (2001).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. J Vis Exp. (113), (2016).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8 (10), 1837-1840 (2013).
- Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).
