Detection och anrikning av sällsynta antigenspecifika B-celler för analys av Fenotyp och funktion
Summary
En enkel men effektiv metod som utnyttjar magnetiska nanopartiklar för att detektera och berika antigenreaktiva B-celler för funktionell och fenotypisk analys beskrivs.
Abstract
B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of <0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.
Introduction
Begränsande utspädning analyser av antikropp-avsöndrande cell prekursor frekvens har föreslagit att B-celler reaktiva mot ett speciellt antigen uppträder typiskt vid en frekvens av 0,05 till 0,005% i det normala repertoaren, beroende på vaccinationsstatus och storlek / antal epitoper närvarande på antigenet. Den låga frekvensen av dessa celler har gjort det svårt att studera förändringar i deras status under utvecklingen av immunsvar, såsom efter vaccination eller exponering för en främmande antigen, eller under utveckling av autoimmunitet. Tidigare har forskare genomfört isolering av antigenreaktiva B-celler med användning av tekniker som sträcker sig från antigenbelagda plattor eller kolumn adsorbenter, till antigenbelagda röda blodkroppar återställning, till fluorescens-aktiverad cellsortering 1, 2, 3, 4, 5, 6. though dessa tekniker har varit framgångsrika i att identifiera och isolera antigenreaktiva B-celler, har resultaten varierat i termer av utbyte, renhet och skalbarhet. Nyligen har vi utvecklat en ny metod för att både upptäcka och berika sällsynta B lymfocytsubpopulationer hjälp av magnetiska nanopartiklar. Metoden möjliggör berikning med relativt högt utbyte och renhet från stora startpopulationer, och är kompatibel med analys av svar på antigen. Genom att berika från populationer av celler i suspension, eliminerar metoden begränsningar som är förknippade med geometrin hos antigenbelagda plattor eller kolumner, och begränsa genomströmning. Slutligen, eftersom anrikade celler förblir associerade med antigen och en fluorescerande reporter, kan de renas ytterligare genom FACS-sortering. Såsom beskrivs häri har vi använt denna metod för undersökning av perifert blod tetanus toxoid-reaktiva B-celler före och efter immunisering av mänskliga försökspersoner, samt autoantigenreaktiva B-celler från patienter med olika autoimmune störningar, inkluderande typ 1-diabetes, Graves sjukdom, och Hashimotos sjukdom 7. Förfarandet fungerar lika bra i mus och människa, och är kompatibel med analys av antigenreaktiva B-celler från en mängd olika vävnader (manuskript under utarbetande).
I sin grundläggande form, är perifera mononukleära blodkroppar först inkuberas med biotinylerat antigen tillsammans med antikroppar mot cell ytantigener som krävs för fenotypisk analys. Denna märkning steg följs av tvättning och fixering, och tillsats av streptavidin kopplat till långt-röd-fluorescerande färgämne för påvisande av det biotinylerade-antigenbindande celler (figur 1). Tidigare studier har identifierat antigenspecifika B-celler på ett liknande sätt men med användning av antigener direkt konjugerad till en fluorokrom 8, 9, 10, 11. Även om detta är en värdigtillvägagångssätt, användning av biotinylerade antigener i samband med streptavidin möjliggör större signalförstärkning (följaktligen bättre differentiering av bindande och icke-bindande celler), i synnerhet när antigener är små 12, 13, 14. En ytterligare faktor är användningen av streptavidin istället för avidin eftersom streptavidin deglykosylerad, minskar icke-specifik bindning. Vidare använder vi långt röda fluorescerande färgämne som fluorokromen på grund av dess foto, kvantutbyte (ljusstyrka) och dess ringa storlek (~ 1,3 kD). Protein fluorokromer såsom fykoerytrin (~ 250 kD) och allofykocyanin (~ 105 kD) 15 är inte optimalt eftersom de potentiellt innehåller många antigenepitoper. Användningen av en liten organisk fluorescerande färgämne sammansatt av en enda epitop, såsom långt-röd-fluorescerande färgämne, reducerar komplexiteten hos den isolerade cellpopulationen.
När celler är biotinylerade-antigen och långt röd-fluorescerande färgämne-streptavidin adsorberat, de berikade med användning av anti-far-röd-fluorescerande färgämne-konjugerad magnetiska nanopartiklar. Enstaka nanopartiklar inte upptäcks av de flesta flödescytometrar och därför inte behöver avlägsnas före rening genom FACS sortering och efterföljande analyser 16. Magnetisk selektion för antigen-specifika B-celler berikar den intressanta populationen, vilket eliminerar den tid och kostnad för sortering sällsynta händelser med användning av en flödescytometer.
Nedan visar representativa resultat från anrikning av tetanus-toxoid-specifika B-celler från en patient före och sju dagar efter tetanustoxoid booster-immunisering. Vi valde detta speciella tillämpning som ett exempel för att demonstrera förmågan hos denna metod för att berika antigenspecifika B-celler efter akut in vivo stimulering. När den kombineras med flödescytometri, är denna metod kan berikande och differentierande antigenspecifik naiv, minne, ochplasmablast B-celler och gör det möjligt för forskaren att följa förändringar i deras frekvens över tiden. Dessutom inkluderar vi en annan möjlig nedströms analys, t ex en ELISPOT-analys, som visar att celler bibehåller förmågan att utsöndra antikropp efter anrikning. En annan tillämpning av denna metod kan innebära adoptiv överföring av anrikade celler i en värd. Vi har tidigare visat celler bibehåller förmågan att verka som antigenpresenterande celler för antigenspecifika T-celler efter isolering och överföring (data visas ej). Därför finns det ett antal möjliga nedströms analyser som skulle kunna kopplas till den metod, som tillsammans informerar förståelsen av den antigenspecifika immunsvar. Vi har beskrivit den metod nedan, inklusive kontroller för att bestämma totala utbytet, renhet, cell specificitet, och vik-anrikning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi en ny metod för att åstadkomma isolering och anrikning av antigenbindande B-celler från humant perifert blod. Metoden är lätt tillämplig på möss och andra vävnader, såsom mjälten och lymfkörtlar, och är kompatibel med post-anrikning analys av cellfenotyp och funktion (manuskript under utarbetande).
Användaren bör vara medveten om ett antal variabler som kan påverka framgången av detta förfarande. Av erfarenhet döda celler tenderar att hålla sig till de m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) and the National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201, and F30OD021477).
Materials
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | e.g. Thermo Scientific | e.g. 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA) | |||
| 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL conical tubes | |||
| 1.5 mL Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
- Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
- Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
- Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
- Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
- Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
- Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
- Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
- Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
- Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
- Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
- Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
- Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).
