Анализ лимфоцитов экстравазации спользование<em> In Vitro</em> Модель человеческого гематоэнцефалический барьер
Summary
Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.
Abstract
Лимфоцит экстравазация в центральную нервную систему (ЦНС) имеет решающее значение для иммунного надзора. Болезни, связанные с изменениями в лимфоцитах кровоподтек может привести к патофизиологических изменений в ЦНС. Таким образом, исследование миграции лимфоцитов в ЦНС важно понимать, воспалительные заболевания ЦНС и для разработки новых подходов терапии. Здесь мы представляем модель в пробирке человеческого гематоэнцефалического барьера для изучения лимфоцитов кровоизлияния. микрососудистый мозг человеческого эндотелиальные клетки (HBMEC) являются confluently, выращенные на пористом полиэтилентерефталате Transwell вставки, чтобы имитировать эндотелий из гематоэнцефалического барьера. Функция Барьера подтверждено блокатора малой зоны иммуногистохимии, трансэндотелиальное электрическое сопротивление (TEER) измерения, а также анализ Evans Blue проникания. Эта модель позволяет исследование диапедеза редких субпопуляций лимфоцитов , такие как CD56 CD16 ярко тусклые / – клетки NK. Furthermруды, влияние других клеток, цитокинов и хемокинов, связанных с болезнью изменений, а также различных схем лечения на миграционный способности лимфоцитов могут быть изучены. И, наконец, воздействие воспалительных стимулов, а также различные режимы лечения на эндотелиальном барьере может быть проанализированы.
Introduction
Лимфоцит миграция из крови в ткань имеет решающее значение для иммунного надзора. Последовательность конкретных молекулярных взаимодействий обеспечивает сайт – специфическое экстравазации в тонком кишечнике, кожи, лимфатических узлов, центральной нервной системы (ЦНС), и других тканей 1. Изменения в миграции лимфоцитов участвуют в патофизиологии ряда широких распространенных заболеваний 2. Миграция в иммунной привилегированном ЦНС жестко регулируется и , соответственно , изменения этого процесса вовлечены в ЦНС заболеваний , связанных как энцефаломиелита 3, оптиконевромиелит, инсульт и рассеянный склероз (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Поэтому важно изучить лимфоциты кровоизлияния, чтобы лучше понять патофизиологию болезни и разработать инструменты для агромелиорация болезни бремени 8, 9, 10, 11, 12.
Лимфоциты мигрируют в ЦНС с помощью различных маршрутов. Экстравазационный через посткапиллярные венули в субарахноидальное пространство через кровь цереброспинальной жидкости барьера в пределах сосудистого сплетения и через гематоэнцефалический барьера, были описаны 1, 13, 14, 15. Миграция через гематоэнцефалический барьер проводится при взаимодействии лимфоцитов с эндотелиальными клетками 14. В отличие от эндотелиальных клеток на периферии, эндотелиальные клетки ЦНС экспрессируют высокие количества плотных молекул перехода, таким образом, строго ограничивая количество клеток и белков, способных пересекать гематоэнцефалический барьердеваха = "Xref"> 16. Результаты Воспаления в разрыхлении плотных контактов и индуцируют экспрессию молекул адгезии; Таким образом, усиление миграции лимфоцитов в ЦНС 1, 17, 18.
Экстравазационный через гематоэнцефалический барьер является многоступенчатым процессом. Лимфоциты привязь к клеткам эндотелия , а затем катиться по эндотелию в процессе , главным образом , опосредованного селектинов 1, 15. Впоследствии, взаимодействия между хемокинов , секретируемых эндотелием и соответствующих рецепторов хемокинов , выраженные на лимфоциты индуцируют конформационные изменения интегринами, тем самым способствуя твердую адгезию к клеткам эндотелия 1. И, наконец, лимфоциты либо ползать по эндотелиальному барьеру против кровотока, прежде чем переселяется в периваскулярное пространстве, или срыв немедленно и непосредственно радиопередающиеigrate на сайте фирмы адгезии 1, 19, 20. Все эти этапы экстравазации лимфоцитов могут быть проанализированы в пробирке с использованием различных методик 21. Покадровое видео микроскопия используется для изучения начальных привязывать и прокатки 15. Адгезионные анализы предоставляют подробную информацию о твердом аресте в эндотелиальные барьеры 22. Трансмиграция анализы , как продемонстрировано здесь , позволяют анализ иммунной клетки трансмиграции 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.
Использование человека в пробирке крови барьер мозга модель, недавно мы могли бы показать , что выше MIGRAtory емкость CD56 CD16 ярко тусклая / – клетки NK по сравнению с их CD56 DIM CD16 + аналоги отражались преобладанием этой субпопуляции NK в интратекальной камере 21. Таким образом, наша экспериментальная установка , кажется, подходит для имитации ситуации в естественных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем технику для исследования перевоплощения лимфоцитов через человек гематоэнцефалического барьера. В пробирке анализа лимфоцитов миграции в ЦНС важно изучить основные процессы лимфоцитарного кровоподтека, потенциальных изменений , связанные с болезнью, и но…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 “Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease” (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).
Materials
| PBS | Gibco | 14190-094 | without CaCl2 or MgCl2 |
| Fibronectin 1mg/mL | Sigma | F1141-5MG | from bovine plasma |
| T-25 cell culture flask | Greiner BioOne | 690160 | |
| HBMEC | ScienCell | 1000 | |
| Pelobiotech | PB-H-6023 | ||
| Accutase | Sigma | A6964-100ML | |
| ECM-b | ScienCell | 1001-b | |
| FBS | ScienCell | 1001-b | |
| Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 1001-b | |
| Endothelial cell growth supplement | ScienCell | 1001-b | |
| Transwell | Corning | 3472 | clear, 6.5mm diameter, 3.0µm pore size |
| 96-well flat bottom plate | Corning | 3596 | |
| Evans blue | Sigma | E2129-10G | stock solution: 1 g/50 mL PBS |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50x concentrated |
| Infinite M200Pro | Tecan | ||
| 96-well black flat bottom plate | Greiner BioOne | 675086 | |
| 48-well plate | Corning | 3526 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 61870-010 | |
| Flow Count Fluorospheres | Beckman Coulter | 7547053 | |
| Na-EDTA | Sigma | E5134 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Gallios 10-color flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| Kaluza 1.5a | Beckman Coulter | ||
| TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| IFN-γ | Peprotech | 300-02 | |
| CD3-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 300430 | clone UCHT1 |
| CD56-PC7 | Beckman Coulter | A21692 | clone N901 |
| CD16-A750 | Beckman Coulter | A66330 | clone 3G8 |
| CD4-FITC | Biolegend | 300506 | clone RPA-T4 |
| CD8-A700 | Beckman Coulter | A66332 | clone B9.11 |
References
- Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3 (7), 569-581 (2003).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
- Furtado, G. C., et al. A novel model of demyelinating encephalomyelitis induced by monocytes and dendritic cells. J Immunol. 177 (10), 6871-6879 (2006).
- Ransohoff, R. M. Illuminating neuromyelitis optica pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1001-1002 (2012).
- Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
- Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 461-471 (2016).
- Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
- Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Kieseier, B. C., Wiendl, H. Immunotherapeutic approaches in MS: update on pathophysiology and emerging agents or strategies 2006. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 7 (1), 35-63 (2007).
- Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Stuve, O., Kieseier, B., Wiendl, H. Multiple sclerosis therapy: an update on recently finished trials. J Neurol. 254 (11), 1473-1490 (2007).
- Wiendl, H., Hohlfeld, R. Multiple sclerosis therapeutics: unexpected outcomes clouding undisputed successes. Neurology. 72 (11), 1008-1015 (2009).
- Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Breuer, J., Posevitz-Fejfar, A., Wiendl, H. JCV index and L-selectin for natalizumab-associated PML risk stratification. Journal of Neuroimmunology. 275 (1-2), 24 (2014).
- Schwab, N., et al. L-selectin is a possible biomarker for individual PML risk in natalizumab-treated MS patients. Neurology. 81 (10), 865-871 (2013).
- Takeshita, Y., Ransohoff, R. M. Inflammatory cell trafficking across the blood-brain barrier: chemokine regulation and in vitro models. Immunol Rev. 248 (1), 228-239 (2012).
- Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Wiendl, H. Trafficking of lymphocytes into the CNS. Oncotarget. 6 (20), 17863-17864 (2015).
- Schneider-Hohendorf, T., et al. VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med. 211 (9), 1833-1846 (2014).
- Girard, J. P., Springer, T. A. High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today. 16 (9), 449-457 (1995).
- Brown, D. A., Sawchenko, P. E. Time course and distribution of inflammatory and neurodegenerative events suggest structural bases for the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Comp Neurol. 502 (2), 236-260 (2007).
- Alvarez, J. I., Cayrol, R., Prat, A. Disruption of central nervous system barriers in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 252-264 (2011).
- Rudolph, H., et al. Postarrest stalling rather than crawling favors CD8+ over CD4+ T-cell migration across the blood-brain barrier under flow in vitro. Eur J Immunol. , (2016).
- Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462 (7269), 94-98 (2009).
- Gross, C. C., et al. Impaired NK-mediated regulation of T-cell activity in multiple sclerosis is reconstituted by IL-2 receptor modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), E2973-E2982 (2016).
- Gross, C. C., Brzostowski, J. A., Liu, D. F., Long, E. O. Tethering of Intercellular Adhesion Molecule on Target Cells Is Required for LFA-1-Dependent NK Cell Adhesion and Granule Polarization. Journal of Immunology. 185 (5), 2918-2926 (2010).
- Grutzke, B., et al. Fingolimod treatment promotes regulatory phenotype and function of B cells. Ann Clin Transl Neurol. 2 (2), 119-130 (2015).
- Gobel, K., et al. Blockade of the kinin receptor B1 protects from autoimmune CNS disease by reducing leukocyte trafficking. J Autoimmun. 36 (2), 106-114 (2011).
- Schneider-Hohendorf, T., et al. Regulatory T cells exhibit enhanced migratory characteristics, a feature impaired in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol. 40 (12), 3581-3590 (2010).
- Huang, Y. H., et al. Specific central nervous system recruitment of HLA-G(+) regulatory T cells in multiple sclerosis. Ann Neurol. 66 (2), 171-183 (2009).
- Dehmel, T., et al. Monomethylfumarate reduces in vitro migration of mononuclear cells. Neurol Sci. 35 (7), 1121-1125 (2014).
- Gastpar, R., et al. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J Immunol. 172 (2), 972-980 (2004).
- Gastpar, R., et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. Cancer Res. 65 (12), 5238-5247 (2005).
- Vandermeeren, M., Janssens, S., Borgers, M., Geysen, J. Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced E-selectin, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 234 (1), 19-23 (1997).
- Rubant, S. A., et al. Dimethylfumarate reduces leukocyte rolling in vivo through modulation of adhesion molecule expression. Journal of Investigative Dermatology. 128 (2), 326-331 (2008).
- Hamann, A., et al. Evidence for an accessory role of LFA-1 in lymphocyte-high endothelium interaction during homing. J Immunol. 140 (3), 693-699 (1988).
- Shamri, R., et al. Lymphocyte arrest requires instantaneous induction of an extended LFA-1 conformation mediated by endothelium-bound chemokines. Nat Immunol. 6 (5), 497-506 (2005).
- Didier, N., et al. Secretion of interleukin-1beta by astrocytes mediates endothelin-1 and tumour necrosis factor-alpha effects on human brain microvascular endothelial cell permeability. J Neurochem. 86 (1), 246-254 (2003).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Sci Rep. 4, 4160 (2014).
- Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain Res. 818 (1), 65-71 (1999).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Curr Drug Metab. 9 (9), 901-910 (2008).
- Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
- Eugenin, E. A., et al. CCL2/monocyte chemoattractant protein-1 mediates enhanced transmigration of human immunodeficiency virus (HIV)-infected leukocytes across the blood-brain barrier: a potential mechanism of HIV-CNS invasion and NeuroAIDS. J Neurosci. 26 (4), 1098-1106 (2006).
- Ubogu, E. E., Callahan, M. K., Tucky, B. H., Ransohoff, R. M. CCR5 expression on monocytes and T cells: modulation by transmigration across the blood-brain barrier in vitro. Cell Immunol. 243 (1), 19-29 (2006).
- Bennett, J., et al. Blood-brain barrier disruption and enhanced vascular permeability in the multiple sclerosis model EAE. J Neuroimmunol. 229 (1-2), 180-191 (2010).
- Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat Immunol. 8 (10), 1076-1085 (2007).
- Ando, J., Nomura, H., Kamiya, A. The effect of fluid shear stress on the migration and proliferation of cultured endothelial cells. Microvasc Res. 33 (1), 62-70 (1987).
- Lawrence, M. B., Smith, C. W., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood. 75 (1), 227-237 (1990).
- Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In Vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. J Pharm Sci. 104 (9), 2727-2746 (2015).
- Cucullo, L., et al. Development of a humanized in vitro blood-brain barrier model to screen for brain penetration of antiepileptic drugs. Epilepsia. 48 (3), 505-516 (2007).
