Analyse av lymfocytt-ekstravasasjon ved hjelp av en<em> In Vitro</em> Modell av det menneskelige blod-hjernebarrieren

Summary

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Abstract

Lymfocytt uttredelse inn i sentralnervesystemet (CNS) er kritisk for immunovervåkning. Sykdomsrelaterte endringer av lymfocytt ekstravasasjon kan resultere i patofysiologiske forandringer i CNS. Således er undersøkelse av lymfocyttmigrering til CNS viktig å forstå inflammatoriske CNS-sykdommer og å utvikle nye tilnærmingsmåter terapi. Her presenterer vi en in vitro modell av det menneskelig blod-hjernebarrieren for å studere lymfocytt ekstravasasjon. Hjernen mikrovaskulære endotelceller (HBMEC) er confluently dyrket på en porøs polyetylentereftalat transwell sette inn for å etterligne endotelet i blod-hjerne-barrieren. Barrierefunksjonen blir bekreftet ved zonula okkludens immunhistokjemi, transendotelial elektrisk motstand (teer) målinger samt analyse av Evans Blue gjennomtrengning. Denne modellen tillater undersøkelse av diapedese av sjeldne lymfocyttundergrupper slik som CD56 CD16 ^{lys dempe / –} NK-celler. Furthermmalm, effekten av andre celler, cytokiner og kjemokiner, sykdomsrelaterte endringer og forskjellige behandlingsregimer på trekk kapasiteten av lymfocytter kan studeres. Til slutt, kan virkningen av inflammatoriske stimuli, så vel som forskjellige behandlingsregimer på den endoteliske barrieren skal analyseres.

Introduction

Lymfocyttmigrering fra blodet inn i vevet er avgjørende for immunologiske overvåkning. En sekvens av spesielle molekylære interaksjoner sørger for setespesifikk uttredelse inn i tynntarmen, hud, lymfeknuter, i sentralnervesystemet (CNS), og andre vev ^1. Endringer i lymfocyttmigrering er involvert i patofysiologien av en rekke store spredningen sykdommer ^2. Migrering inn i den immun-privilegerte CNS er strengt regulert og følgelig endringer av denne prosess er involvert i CNS-relaterte sykdommer som encefalomyelitt ^3, neuromyelitis optica, slag, og multippel sklerose (MS) ^{2, 4, 5, 6, 7.} Derfor er det viktig å studere lymfocytt bloduttredelse å bedre forstå sykdom patofysiologi og å utvikle verktøy for en landgjenvinning av sykdomsbyrde ^{8, 9, 10, 11, 12.}

Lymfocytter migrere inn i CNS via forskjellige ruter. Ekstravasering gjennom postkapillare venuler i det subarachnoide plass via blodet-cerebrospinalvæsken barrieren innenfor choroid plexus og over blod-hjernebarrieren er blitt beskrevet ^{1, 13, 14, 15.} Migrasjon over blod-hjerne barrieren er utført av interaksjon av lymfocytter med endotelceller ^14. I motsetning til endotelceller i periferien, endotelceller i CNS uttrykker store mengder av stramme koblingsmolekyler, for derved å strengt begrense mengden av celler og proteiner som er i stand til å krysse blod-hjerne-barrierenlass = "ekstern referanse"> 16. Inflammasjon resulterer i løsning av tette forbindelsene og induserer ekspresjon av adhesjonsmolekyler; således forsterke lymfocyttmigrering til CNS ^{1, 17, 18.}

Ekstravasering gjennom blod-hjerne-barrieren er en flertrinnsprosess. Lymfocytter tjore til endotelcellene og deretter rulle langs den endotelet i en prosess som først og fremst formidlet av selektiner ^{1, 15.} Deretter interaksjoner mellom chemokiner utskilt av endotelet og de respektive kjemokin reseptorer uttrykt på lymfocytter indusere konformasjonsendringer av integriner og dermed fremme fast adhesjon til endotelceller ^1. Til slutt, lymfocytter enten gjennomsøking langs den endoteliske barrieren mot blodstrømmen før transmigrating inn i perivaskulære plass, eller stall umiddelbart og direkte Transmigrate på stedet av fast adhesjon ^{1, 19, 20.} Alle disse trinnene å lymfocytt ekstravasasjon kan analyseres in vitro ved anvendelse av forskjellige teknikker ^21. Time-lapse video mikroskopi brukes til å studere innledende tethering og rullende ^15. Adhesjonsassayene gi detaljert informasjon om firmaet arrest til endotelbarrierer ^22. Sjele assays som demonstrert her tillate analyse av immun-celle-transmigrasjon ^{21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.}

Ved å bruke den humane in vitro blod-hjerne barrieren modell, kunne vi nylig viser at en høyere MIGRAtory kapasitet av CD56 CD16 ^{lys dempe / –} NK-celler i forhold til deres CD56 ^dim CD16 ⁺ motstykker ble reflektert ved en overvekt av denne NK-celleundergruppen i det intratekale rommet ^21. Dermed synes vår eksperimentelle oppsett for å være egnet til å etterligne in vivo situasjonen.

Protocol

1. Cellekultur av human hjerne mikrovaskulær endotelceller (HBMEC) Belegg av cellekulturflasker For å fremstille den fibronektin løsningen, tilsett 10 ml PBS til et 15 ml sentrifugerør. Tilsett 150 mL fibronektin og bland godt. For å dekke den nederste en T-25-cellekulturflaske tilsett 2 ml av den løsning fibronektin. Inkuber cellekulturflaske i minst 3 timer ved 37 ° C i inkubatoren. Fibronectinbelagt kolber kan lagres i 2 uker ved 37 ° C / 5% CO2. Se…

Representative Results

Representative resultater som viser transmigrasjon av NK-celler og T-celleundergrupper ved hjelp av menneskelig blod-hjerne-barrieren modellen (figur 1A) er vist. Integriteten til HBMEC monolaget ble bekreftet ved farging av den stramme koblingsmolekylet ZO-1, transendotelial elektrisk motstand (teer) målinger, og Evans Blue permeasjon (figur 1B). Etter 3 – 4 dagers dyrking HBMEC uttrykt det stramme koblingsmolekylet ZO-1 (figur 1 B, ve…

Discussion

Her presenterer vi en teknikk for å undersøke sjele av lymfocytter over menneskelig blod-hjerne barrieren. In vitro-analyse av lymfocyttmigrering til CNS er viktig å undersøke grunnleggende prosesser for lymfocytt ekstravasasjon, potensielle sykdomsrelaterte endringer, og nye terapeutiske tilnærminger.

Flere modifikasjoner av blod-hjerne-barrieren modell er mulig. For eksempel kan celler fra det øvre kammeret bli analysert for å undersøke sammensetningen av den ikke-overfør…

Materials

PBS	Gibco	14190-094	without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1mg/mL	Sigma	F1141-5MG	from bovine plasma
T-25 cell culture flask	Greiner BioOne	690160
HBMEC	ScienCell	1000
	Pelobiotech	PB-H-6023
Accutase	Sigma	A6964-100ML
ECM-b	ScienCell	1001-b
FBS	ScienCell	1001-b
Penicillin/Streptomycin	ScienCell	1001-b
Endothelial cell growth supplement	ScienCell	1001-b
Transwell	Corning	3472	clear, 6.5mm diameter, 3.0µm pore size
96-well flat bottom plate	Corning	3596
Evans blue	Sigma	E2129-10G	stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27	Gibco	17504-044	50x concentrated
Infinite M200Pro	Tecan
96-well black flat bottom plate	Greiner BioOne	675086
48-well plate	Corning	3526
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Flow Count Fluorospheres	Beckman Coulter	7547053
Na-EDTA	Sigma	E5134
BSA	Sigma	A2153
Gallios 10-color flow cytometer	Beckman Coulter
Kaluza 1.5a	Beckman Coulter
TNF-α	Peprotech	300-01A
IFN-γ	Peprotech	300-02
CD3-PerCP/Cy5.5	Biolegend	300430	clone UCHT1
CD56-PC7	Beckman Coulter	A21692	clone N901
CD16-A750	Beckman Coulter	A66330	clone 3G8
CD4-FITC	Biolegend	300506	clone RPA-T4
CD8-A700	Beckman Coulter	A66332	clone B9.11