延长急性神经组织孵育时间用于电生理学和钙成像

摘要

一旦神经组织被从体内取出，其会受到环境条件的显著影响，导致在6至8小时后逐渐降解。通过一种独特的孵育方法，可对组织的细胞外环境进行密切监测和精确调控，从而将组织活性显著延长至>24小时。

摘要

急性神经组织制备物，如脑切片和视网膜全层标本，通常在解剖后仅能维持6 - 8小时。这限制了实验时间，并增加了每项研究所需的动物数量。这一限制尤其影响需要长时间预孵育并使用浴式施加染料的实验方案，例如钙成像。切片后3 - 4小时内细菌呈指数级增长，与组织健康状况下降密切相关。本研究描述了一种方法，可 限制急性制备物中细菌的增殖，从而在无需抗生素、无菌操作或含生长因子的组织培养基的条件下，将神经组织维持在可存活状态超过>24小时。通过将细胞外液循环经过紫外照射，并将组织置于定制的保存室中，保持温度为15 - 16 °C，解剖后>24小时的组织在电生理特性或通过细胞内钙染料检测的钙信号方面均未表现出差异。这些方法不仅将延长使用急性神经组织的研究者的实验时间，还将减少完成实验目标所需的动物数量，并为急性神经组织的孵育建立黄金标准。

引言

电生理学和功能成像（钙离子、电压敏感性染料）是神经科学中最常用的两种实验技术。本文将探讨脑切片和视网膜全层标本，这些制备方法可在不受麻醉剂或肌肉松弛剂干扰的情况下，用于研究电生理特性和突触连接性。与细胞培养物或组织匀浆不同，脑切片和视网膜全层标本能保持其结构完整性，从而允许对特定神经环路和脑网络进行研究¹离体组织记录相较于其他方法具有以下优势 体内 通过消除与心跳和呼吸相关的运动，可获得稳定的记录。此外，直接可视化技术能够靶向特定类型的细胞，并实现药理学工具的局部应用 ^2,3.

在视网膜全层标本中进行膜片钳记录和钙染料负载时，内界膜（ILM）的存在带来了困难，因为该膜覆盖在视网膜神经节细胞（RGC）层表面，阻碍了对细胞的直接接触。通常需要使用玻璃移液管刮除该膜，以便直接应用膜片钳移液管并在单个细胞上形成吉欧姆密封。此外，浴施加的钙 染料无法穿过内界膜，因此必须将其注射至该膜下方⁴，或通过视神经注射后经逆行运输⁵，或通过电穿孔方式导入组织⁶。此外，在使用视网膜色素变性的小鼠模型（rd/rd 小鼠）时，内界膜更厚且更难穿透。本文中....

方案

以下方案描述了C57BL/6和C3H/He（视网膜变性）小鼠神经组织的制备过程，但类似技术也可应用于其他物种。所有动物均健康，并在标准的温度、湿度、12小时明暗循环条件下饲养，自由获取食物和水，且未施加任何有意的压力刺激。所有实验均经西悉尼大学动物护理与伦理委员会批准，并遵循动物使用与护理指南（动物研究许可号 #A9452、#A10396 和 #A8967）进行。

1. 脑切片制备

1. 通过吸入异氟烷（5%）麻醉动物，并使用啮齿类动物断头器进行断头。迅速取出脑组织，方法如前所述⁹，并将其置于冰冻的生理溶液（aCSF）中，溶液成分（单位为 mM）如下：125 NaCl、2.5 KCl、1 MgCl₂、1.25 NaH₂PO₄、2 CaCl₂、25 NaHCO₃、25 葡萄糖，并用碳合气（95% O₂/5% CO₂ 混合气体）饱和（310 mOsm；pH 7.4）。
2. 使用振动切片机在目标区域切割厚度为 300 µm 的脑片。
3. 将脑片转移至自行设计的孵育系统中，该系统可密切监测并控制 pH 值（pH 7.2 - 7.4）、碳合气流速和温度，具体如前所述^10,11....

结果

在孵育过程中，严格调控人工脑脊液（aCSF）中的细菌载量和温度对于维持神经组织活性至关重要。可通过UVC光照辐照以及将aCSF温度维持在15 - 16 °C (图1）。此外，aCSF 参数印章（APS； 图1C为实验者提供了环境条件（pH 和温度）的记录，从而为神经组织孵育时的参数设定提供了金标准，遵循该标准可减少实验间的变异性。

图1. 一种可精确调控组织环境的孵育系统。A， 孵育系统的示意图，由制冷帕尔贴板、主腔室、蠕动泵和UVC腔室组成。B，主腔室的侧视图，显示了人工脑脊液（aCSF）的入口和.......

讨论

本文介绍了一种孵育方法，可延长急性神经组织在成像和电生理实验中的活性，从而减少实现实验目标所需的动物数量。神经组织随时间推移而退化的两个主要过程为：i）细菌水平升高及其伴随释放的细菌内毒素增加；ii）继创伤性切片操作后出现的兴奋性毒性¹⁰由于急性神经组织对外界环境缺乏保护能力，因此必须通过密切监测pH值、温度和细菌水平，严格调控组织环境，以维持细胞活性及神经网络的完整性。组织分离及处理（包括木瓜蛋白酶消化、钙离子染料负载）可能耗时超过2小时，导致实际可用于实验的时间缩短。然而，由于组织可在孵育系统中保存 >24 小时内活力未出现可测量的下降^7,8，此制备步骤仅需完成一次即可获得 >24 小时的结果。作为 3R 策略的一部分 （替代、减少、优化） 旨在为动物的伦理使用提供指导原则¹⁶该方法将对减少此类实验中动物的使用数量产生重大影响。

消化.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	Sigma Aldrich VETEC	V800372
氯化钾	Sigma Aldrich	P9333
N-甲基-D-葡糖胺	Sigma Aldrich	M2004
D-葡萄糖	Sigma Aldrich	G5767
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	S6014
磷酸二氢钠	Sigma Aldrich	S2554
氯化镁	Sigma Aldrich	M9272
氯化钙	Sigma Aldrich	223506
木瓜蛋白酶解离系统	Worthington	LK003150
无水二甲基亚砜	Sigma Aldrich	276855
Pluronic F-127 低紫外吸收*	Life technologies	P-6867	DMSO 中的 20% 溶液
Fura-2 AM	Anaspec	84017
Fluo-4 AM	Life Technologies	F23917
Fluo-8 AM	Abcam	Ab142773
振动切片机	Leica Biosystem	VT1200 S	配备 Leica’s Vibrocheck™ 测量装置
防震台	Kinetic Systems Vibraplane	Vibraplane 9100/9200
固定载物台直立显微镜	Olympus	BX51WI
显微镜物镜	Olympus	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20X
显微镜物镜	Olympus	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60X
CCD 相机	Andor	Ixon +
高速波长切换器	Sutter instrument	Lambda DG-4
膜片钳放大器	Molecular Devices	MultiClamp 700B
数据采集系统	Molecular Devices	Digidata 1440A	Axon Digidata® 系统
硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter Instrument Co	BF150-86-10
微电极拉制仪	Sutter Instrument Co	P-97	Flaming/Brown 型微管拉制仪
记录/灌流腔室	Warner Instruments	RC-40LP	低剖面开放式浴槽腔室
软件	Molecular Devices	pClamp 10.2
Andor iQ 活细胞成像软件	Andor	Andor iQ3
Braincubator	Payo Scientific	BR26021976	www.braincubator.com.au
帕尔贴热电制冷板冷却器	TE Technology	CP-121
温度控制器	TE Technology	TC-36-25 RS232