فقدان متفاوتة من متوسطة من صفيحة معايرة دقيقة يؤثر على استنساخ تشكيل الورم كروي متعددة الخلايا موحد. تحسين ظروف التربية للحد من فقدان المتوسطة هامة من شأنها تحسين استنساخ تشكيل كروي ونتائج فحوصات على أساس كروي باستخدام تقنية السائل تراكب.
نماذج الورم التي تشبه عن كثب في ظروف المجراة تزداد شعبية في اكتشاف وتطوير الأدوية لفحص المخدرات المحتملة المضادة للسرطان. الكروية ورم الخلايا (MCTSes) تحاكي بشكل فعال الظروف الفسيولوجية من الأورام الصلبة، مما يجعلها ممتازة نماذج في المختبر لتعظيم الاستفادة الرصاص والتحقق من صحة الهدف. من مختلف التقنيات المتاحة للثقافة MCTS، طريقة السائل تراكب على الاغاروز هي واحدة من أكثر الطرق غير مكلفة لتوليد المراكز. ومع ذلك، فإن نقل موثوق بها من الثقافات المراكز باستخدام السائل تراكب لفحص عالية الإنتاجية يجوز المساس بها عدد من القيود، بما في ذلك طلاء صفيحة معايرة دقيقة (النواب) مع الاغاروز وirreproducibility من تشكيل المراكز موحد عبر الآبار. نواب عرضة بشكل كبير إلى حافة الآثار التي تنتج عن تبخر الزائد من المتوسط من الخارج من لوحة، ومنع استخدام لوحة كاملة لمكافحة المخدراتالاختبارات. توفر هذه المخطوطة التحسينات الفنية التفصيلية لأسلوب السائل تراكب لزيادة قابلية واستنساخ تشكيل المراكز موحد. بالإضافة إلى ذلك، وتفاصيل عن بسيط، وأداة البرمجيات شبه التلقائي، وقابلة للتطبيق عالميا لتقييم المراكز ميزات بعد عرض العلاج من تعاطي المخدرات.
يتم ترتيب الخلايا السرطانية في الأورام من الناحية الفسيولوجية في بنية معقدة، 3 الأبعاد (3D) وتحيط بها المصفوفة خارج الخلية والخلايا التفاعل. ان ما يقرب من جميع الخلايا في الأنسجة الموجودة في بيئة 3D، أدى الحاجة إلى أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية في نماذج ورم في المختبر التي تحاكي صفات الورم في تطوير العديد من التقنيات ثقافة 3D 1، 2، 3. هذه النماذج أصبحت الآن أدوات البحث الأساسية لدراسة دور المكروية ورم خبيث في الخلايا وردا على العلاجات في 3D 2. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع 2-الأبعاد الثقافات (2D) خلية 4، 3D نماذج تسمح لفهم أفضل للتفاعلات ورم سدى، والتي تؤثر على خلية مسارات الإشارات.
وكثيرا ما تستخدم الكروية ورم الخلايا (MCTSes) من خطوط الخلايا السرطانية في 3D الخلية جنماذج ulture بسبب القرب النسبي لفي الجسم الحي الأورام. للخروج من العديد من التقنيات في الاستخدام، وقد اكتسب تقنية السائل تراكب (الكثير) من الجيل المراكز على لوحات المغلفة الاغاروز اهتماما كبيرا للرصاص الأمثل والهدف التحقق من صحة 5، 6، 7، 8، 9، 10، 11. وهذا واضح من الدراسات الحديثة التي استطاعت بنجاح لتشغيل شاشات التجريبية من المكتبات مجمع في الثقافات المراكز باستخدام الكثير 6 و 7. ومع ذلك، وتقلب جيدا لجيدا في المراكز التشكل والنمو بسبب فقدان الناجم عن تبخر متفاوتة من متوسطة عقبات المشتركة التي تصاحب الكثير باستخدام صفيحة معايرة دقيقة (النواب). ونتيجة لذلك، وتشكيل غير موحدة MCTSes يؤثر سلبا على أهمية وجدوىبيانات من فحوصات الدوائية 8 و 12 و 13. بالإضافة إلى قضايا استنساخ، مشكلة عملية أخرى تؤثر على أساس LOT-فحوصات عالية الإنتاجية هي طلاء النواب مع الاغاروز عند استخدام السائل التلقائي وحدات الاستغناء. على الرغم من أن وحدة الاستغناء يمكن أن تظل ساخنة لمنع التبلور من الاغاروز، وانسداد الكاسيت صرفها والأنابيب هو مصدر قلق محتمل لأنظمة روبوتية 6.
للتغلب على بعض من هذه التحديات، ونحن قد وضعت مؤخرا بعض التعديلات في الكثير من أجل الثقافة MCTS 8. وتستند هذه التعديلات أساسا على السبل الممكنة لمنع فقدان المتوسطة متفاوتة من النواب باستخدام الأدوات التي توجد عادة في المختبرات فحص عالية الإنتاجية. إجراء مفصل من الكثير المعدلة لتوليد MCTSes الحجم بشكل موحد واستنساخه عبر 3وقدم لوحات 84-جيدا (WPS) هنا. يعرض المخطوطة أيضا روتين مؤتمتة شبه لتقييم حجم المراكز، لا سيما في MCTSes تفككت جزئيا، المعالجة المخدرات التي ليس لها حدود واضحة المعالم لقياس مساحة المقطع العرضي.
طلاء 384 حسنا لوحات TC مع المصفاة الاغاروز
الممارسة القياسية في الكثير هو استخدام 1-1.5٪ منخفضة ذوبان نقطة الاغاروز لمعطف لوحات، الأمر الذي يتطلب الاغاروز و / أو وحدة الاستغناء أن تبقى ساخنة لمنع التبلور من الاغاروز 6. في ا?…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من وزارة التشيك التربية والتعليم والشباب والرياضة (LO1304) والوكالة التكنولوجية للجمهورية التشيكية (TE01020028). فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور اكشمان فاراناسي لأخذ الصور الثابتة من الأغطية البيئية.
Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Low-melting |
McCOY's 5A Medium | Sigma-Aldrich | M8403 | |
“rapid” Filtermax filter | TPP | 99505 | 0.22 μm, 500 mL |
Multidrop™ Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | |
Small Tube Dispensing cassette | Thermo Fisher Scientific | 24073295 | Metal tip |
384-well TC plate | PerkinElmer | 6057308 | Plate type- CellCarrier |
Standard Tube Dispensing Cassette | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | |
MicroClime Environmental Lid | Labcyte | LLS-0310 | |
DMSO | Sigma | D4540 | |
Rotary Incubator (SteriStore ) | HighRes Biosolutions | 23641 | Serial No.: D00384 |
Microplate Washer Dispenser | BioTek | Unspecified | Model: EL406 |
High-Content Imaging System (CellVoyager ) | Yokogawa Electric Corporation | Unspecified | Model: CV7000 |
Orange G | New England Biolabs | B7022S | |
TrypLE™ Express recombinant cell dissociation reagent | Thermo Fisher Scientific | 12604021 | Phenol red free |