تبخر تخفيض الشرط الثقافة يزيد من القدرة على التكاثر من متعددة الخلايا كروي التشكيل في صفيحة معايرة دقيقة
Summary
فقدان متفاوتة من متوسطة من صفيحة معايرة دقيقة يؤثر على استنساخ تشكيل الورم كروي متعددة الخلايا موحد. تحسين ظروف التربية للحد من فقدان المتوسطة هامة من شأنها تحسين استنساخ تشكيل كروي ونتائج فحوصات على أساس كروي باستخدام تقنية السائل تراكب.
Abstract
نماذج الورم التي تشبه عن كثب في ظروف المجراة تزداد شعبية في اكتشاف وتطوير الأدوية لفحص المخدرات المحتملة المضادة للسرطان. الكروية ورم الخلايا (MCTSes) تحاكي بشكل فعال الظروف الفسيولوجية من الأورام الصلبة، مما يجعلها ممتازة نماذج في المختبر لتعظيم الاستفادة الرصاص والتحقق من صحة الهدف. من مختلف التقنيات المتاحة للثقافة MCTS، طريقة السائل تراكب على الاغاروز هي واحدة من أكثر الطرق غير مكلفة لتوليد المراكز. ومع ذلك، فإن نقل موثوق بها من الثقافات المراكز باستخدام السائل تراكب لفحص عالية الإنتاجية يجوز المساس بها عدد من القيود، بما في ذلك طلاء صفيحة معايرة دقيقة (النواب) مع الاغاروز وirreproducibility من تشكيل المراكز موحد عبر الآبار. نواب عرضة بشكل كبير إلى حافة الآثار التي تنتج عن تبخر الزائد من المتوسط من الخارج من لوحة، ومنع استخدام لوحة كاملة لمكافحة المخدراتالاختبارات. توفر هذه المخطوطة التحسينات الفنية التفصيلية لأسلوب السائل تراكب لزيادة قابلية واستنساخ تشكيل المراكز موحد. بالإضافة إلى ذلك، وتفاصيل عن بسيط، وأداة البرمجيات شبه التلقائي، وقابلة للتطبيق عالميا لتقييم المراكز ميزات بعد عرض العلاج من تعاطي المخدرات.
Introduction
يتم ترتيب الخلايا السرطانية في الأورام من الناحية الفسيولوجية في بنية معقدة، 3 الأبعاد (3D) وتحيط بها المصفوفة خارج الخلية والخلايا التفاعل. ان ما يقرب من جميع الخلايا في الأنسجة الموجودة في بيئة 3D، أدى الحاجة إلى أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية في نماذج ورم في المختبر التي تحاكي صفات الورم في تطوير العديد من التقنيات ثقافة 3D 1، 2، 3. هذه النماذج أصبحت الآن أدوات البحث الأساسية لدراسة دور المكروية ورم خبيث في الخلايا وردا على العلاجات في 3D 2. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع 2-الأبعاد الثقافات (2D) خلية 4، 3D نماذج تسمح لفهم أفضل للتفاعلات ورم سدى، والتي تؤثر على خلية مسارات الإشارات.
وكثيرا ما تستخدم الكروية ورم الخلايا (MCTSes) من خطوط الخلايا السرطانية في 3D الخلية جنماذج ulture بسبب القرب النسبي لفي الجسم الحي الأورام. للخروج من العديد من التقنيات في الاستخدام، وقد اكتسب تقنية السائل تراكب (الكثير) من الجيل المراكز على لوحات المغلفة الاغاروز اهتماما كبيرا للرصاص الأمثل والهدف التحقق من صحة 5، 6، 7، 8، 9، 10، 11. وهذا واضح من الدراسات الحديثة التي استطاعت بنجاح لتشغيل شاشات التجريبية من المكتبات مجمع في الثقافات المراكز باستخدام الكثير 6 و 7. ومع ذلك، وتقلب جيدا لجيدا في المراكز التشكل والنمو بسبب فقدان الناجم عن تبخر متفاوتة من متوسطة عقبات المشتركة التي تصاحب الكثير باستخدام صفيحة معايرة دقيقة (النواب). ونتيجة لذلك، وتشكيل غير موحدة MCTSes يؤثر سلبا على أهمية وجدوىبيانات من فحوصات الدوائية 8 و 12 و 13. بالإضافة إلى قضايا استنساخ، مشكلة عملية أخرى تؤثر على أساس LOT-فحوصات عالية الإنتاجية هي طلاء النواب مع الاغاروز عند استخدام السائل التلقائي وحدات الاستغناء. على الرغم من أن وحدة الاستغناء يمكن أن تظل ساخنة لمنع التبلور من الاغاروز، وانسداد الكاسيت صرفها والأنابيب هو مصدر قلق محتمل لأنظمة روبوتية 6.
للتغلب على بعض من هذه التحديات، ونحن قد وضعت مؤخرا بعض التعديلات في الكثير من أجل الثقافة MCTS 8. وتستند هذه التعديلات أساسا على السبل الممكنة لمنع فقدان المتوسطة متفاوتة من النواب باستخدام الأدوات التي توجد عادة في المختبرات فحص عالية الإنتاجية. إجراء مفصل من الكثير المعدلة لتوليد MCTSes الحجم بشكل موحد واستنساخه عبر 3وقدم لوحات 84-جيدا (WPS) هنا. يعرض المخطوطة أيضا روتين مؤتمتة شبه لتقييم حجم المراكز، لا سيما في MCTSes تفككت جزئيا، المعالجة المخدرات التي ليس لها حدود واضحة المعالم لقياس مساحة المقطع العرضي.
Protocol
Representative Results
Discussion
طلاء 384 حسنا لوحات TC مع المصفاة الاغاروز
الممارسة القياسية في الكثير هو استخدام 1-1.5٪ منخفضة ذوبان نقطة الاغاروز لمعطف لوحات، الأمر الذي يتطلب الاغاروز و / أو وحدة الاستغناء أن تبقى ساخنة لمنع التبلور من الاغاروز 6. في ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من وزارة التشيك التربية والتعليم والشباب والرياضة (LO1304) والوكالة التكنولوجية للجمهورية التشيكية (TE01020028). فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور اكشمان فاراناسي لأخذ الصور الثابتة من الأغطية البيئية.
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Low-melting |
| McCOY's 5A Medium | Sigma-Aldrich | M8403 | |
| “rapid” Filtermax filter | TPP | 99505 | 0.22 μm, 500 mL |
| Multidrop™ Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | |
| Small Tube Dispensing cassette | Thermo Fisher Scientific | 24073295 | Metal tip |
| 384-well TC plate | PerkinElmer | 6057308 | Plate type- CellCarrier |
| Standard Tube Dispensing Cassette | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | |
| MicroClime Environmental Lid | Labcyte | LLS-0310 | |
| DMSO | Sigma | D4540 | |
| Rotary Incubator (SteriStore ) | HighRes Biosolutions | 23641 | Serial No.: D00384 |
| Microplate Washer Dispenser | BioTek | Unspecified | Model: EL406 |
| High-Content Imaging System (CellVoyager ) | Yokogawa Electric Corporation | Unspecified | Model: CV7000 |
| Orange G | New England Biolabs | B7022S | |
| TrypLE™ Express recombinant cell dissociation reagent | Thermo Fisher Scientific | 12604021 | Phenol red free |
References
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
- Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening. Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).
- Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).
- Lao, Z., et al. Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells & Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA. PLoS ONE. 10 (7), e0133895 (2015).
- Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).
- Li, Q., et al. 3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen. J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).
- Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation. J. Biomol. Screen. , (2016).
- Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Sci. Rep. 17 (4), 3751 (2014).
- Solomon, M. A., Lemera, J., D’Souza, G. G. M. Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics. J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).
- Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).
- Walzl, A., et al. A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity. Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).
- Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays. Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci. Rep. 6, 19103 (2016).
- Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes. Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures. Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).
- Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically. J. Vis. Exp. (89), e51639 (2014).
