वाष्पीकरण को कम करने के संस्कृति हालत microtiter प्लेट में बहुकोशिकीय उपगोल गठन के reproducibility बढ़ जाती है
Summary
microtiter प्लेटों से मध्यम के असमान नुकसान वर्दी बहुकोशिकीय ट्यूमर अंडाकार आकृति गठन के reproducibility प्रभावित करता है। संस्कृति स्थिति में सुधार महत्वपूर्ण मध्यम नुकसान अंडाकार आकृति गठन के reproducibility और तरल-ओवरले तकनीक का उपयोग कर अंडाकार आकृति आधारित assays के परिणामों में सुधार होगा कम करने के लिए।
Abstract
ट्यूमर मॉडल है कि निकट vivo परिस्थितियों में नकल दवाओं की खोज और संभावित कैंसर रोधी दवाओं की जांच के लिए विकास में तेजी से लोकप्रिय होते जा रहे हैं। बहुकोशिकीय ट्यूमर spheroids (MCTSes) को प्रभावी ढंग ठोस ट्यूमर की शारीरिक स्थिति की नकल, उन्हें नेतृत्व अनुकूलन और लक्ष्य सत्यापन के लिए इन विट्रो मॉडल में उत्कृष्ट बना रही है। MCTS संस्कृति के लिए उपलब्ध विभिन्न तकनीकों में से agarose पर तरल ओवरले विधि MCTS पीढ़ी के लिए सबसे सस्ती तरीकों में से एक है। हालांकि, उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए तरल ओवरले का उपयोग कर MCTS संस्कृतियों का विश्वसनीय हस्तांतरण agarose के साथ microtiter प्लेट (सांसद) की कोटिंग और कुओं भर में एक समान MCTS गठन की irreproducibility सहित सीमाओं की एक संख्या है, से समझौता किया जा सकता है। सांसदों काफी प्रभाव है कि थाली के बाहर से मध्यम के अत्यधिक वाष्पीकरण से परिणाम बढ़त होने का खतरा है, दवा के लिए पूरी थाली के प्रयोग को रोकनेपरीक्षण। यह पांडुलिपि तरल ओवरले तकनीक scalability और वर्दी MCTS गठन के reproducibility बढ़ाने के लिए विस्तृत तकनीकी सुधार प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, MCTS के मूल्यांकन के लिए एक सरल, अर्द्ध स्वचालित, और सार्वभौमिक रूप से लागू सॉफ्टवेयर उपकरण पर विवरण के बाद नशीली दवाओं के उपचार में प्रस्तुत किया है सुविधाएँ।
Introduction
ट्यूमर में कैंसर की कोशिकाओं physiologically एक जटिल, 3-आयामी (3 डी) बाह्य मैट्रिक्स और बातचीत के दौरान कोशिकाओं से घिरा संरचना में व्यवस्थित कर रहे हैं। के रूप में लगभग ऊतकों में सभी कोशिकाओं को एक 3 डी वातावरण में रहते हैं, और अधिक physiologically विट्रो ट्यूमर मॉडल है कि ट्यूमर के लक्षण नकल में प्रासंगिक के लिए जरूरत के कई 3 डी तकनीक संस्कृति 1, 2, 3 के विकास में हुई है। इन मॉडलों को अब 3 डी 2 में चिकित्सा विज्ञान के लिए मेटास्टेसिस और सेल प्रतिक्रिया पर ट्यूमर microenvironment की भूमिका का अध्ययन करने के लिए मौलिक अनुसंधान उपकरण होते जा रहे हैं। इसके अलावा, 2-आयामी (2 डी) सेल संस्कृतियों 4 की तुलना में, 3 डी मॉडल ट्यूमर स्ट्रोमा बातचीत, जो सेल संकेत दे रास्ते को प्रभावित करने का एक बेहतर समझ के लिए अनुमति देते हैं।
बहुकोशिकीय ट्यूमर spheroids कैंसर कोशिका लाइनों के (MCTSes) अक्सर 3 डी सेल ग में इस्तेमाल कर रहे हैंulture इन विवो ट्यूमर के लिए उनके रिश्तेदार निकटता के कारण मॉडल। उपयोग में कई तकनीकों से बाहर, agarose में लिपटे प्लेटों पर MCTS पीढ़ी के तरल-ओवरले तकनीक (बहुत) नेतृत्व अनुकूलन और लक्ष्य सत्यापन 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 के लिए महत्वपूर्ण ब्याज का फायदा हुआ है। इस हाल के अध्ययनों से पता है कि सफलतापूर्वक बहुत 6, 7 का उपयोग कर MCTS संस्कृतियों में यौगिक पुस्तकालयों के पायलट स्क्रीन चलाने के लिए सक्षम थे से स्पष्ट है। हालांकि, वाष्पीकरण प्रेरित माध्यम की असमान कमी की वजह से MCTS आकृति विज्ञान और विकास में अच्छी तरह से करने के लिए अच्छी तरह से परिवर्तनशीलता आम बाधाएं है कि बहुत से microtiter प्लेट का उपयोग (सांसद) के साथ कर रहे हैं। नतीजतन, गैर वर्दी MCTSes के गठन के महत्व और प्रासंगिकता समझौताऔषधीय assays 8, 12, 13 से डेटा का। reproducibility के मुद्दों के अलावा, एक और व्यावहारिक समस्या बहुत आधारित उच्च throughput assays प्रभावित करता है जब स्वत: तरल इकाइयों वितरण का उपयोग कर agarose के साथ सांसदों की कोटिंग है। हालांकि वितरण इकाई agarose की बीच बढ़िया तालमेल को रोकने के लिए गर्म रखा जा सकता है, वितरण कैसेट और ट्यूबिंग के clogging रोबोट सिस्टम 6 के लिए एक संभावित चिंता का विषय है।
इन चुनौतियों में से कुछ पर काबू पाने के लिए, हम हाल ही में MCTS संस्कृति 8 के लिए बहुत कुछ में कुछ संशोधनों तैयार कर लिया है। इन संशोधनों मुख्य रूप से उपकरणों का उपयोग कर सांसदों है कि आमतौर पर उच्च throughput स्क्रीनिंग प्रयोगशालाओं में पाया जाता है से असमान मध्यम नुकसान को रोकने के लिए संभव तरीके पर आधारित हैं। 3 भर में समान आकार और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने MCTSes की पीढ़ी के लिए संशोधित बहुत की एक विस्तृत प्रक्रिया84 अच्छी तरह प्लेटें (WPS) यहां प्रस्तुत किया है। पांडुलिपि भी MCTS आकार के मूल्यांकन के लिए एक अर्ध-स्वचालित दिनचर्या प्रस्तुत करता है, विशेष रूप से आंशिक रूप से विघटित, दवा इलाज MCTSes कि पार के अनुभागीय क्षेत्र की माप के लिए एक स्पष्ट रूप से परिभाषित सीमा नहीं है में।
Protocol
Representative Results
Discussion
छानने agarose के साथ 384 अच्छी तरह से टीसी प्लेट्स कोटिंग
बहुत कुछ में मानक अभ्यास प्लेटें, जो agarose और / या वितरण इकाई की आवश्यकता है agarose 6 के बीच बढ़िया तालमेल को रोकने के लिए गर्म रखा जाना कोट क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम शिक्षा, युवा, और खेल (LO1304) के चेक मंत्रालय और चेक गणराज्य की तकनीकी एजेंसी (TE01020028) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। लेखकों पर्यावरण पलकों की अभी भी छवियों को लेने के लिए डॉ लक्ष्मण वाराणसी का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Low-melting |
| McCOY's 5A Medium | Sigma-Aldrich | M8403 | |
| “rapid” Filtermax filter | TPP | 99505 | 0.22 μm, 500 mL |
| Multidrop™ Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | |
| Small Tube Dispensing cassette | Thermo Fisher Scientific | 24073295 | Metal tip |
| 384-well TC plate | PerkinElmer | 6057308 | Plate type- CellCarrier |
| Standard Tube Dispensing Cassette | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | |
| MicroClime Environmental Lid | Labcyte | LLS-0310 | |
| DMSO | Sigma | D4540 | |
| Rotary Incubator (SteriStore ) | HighRes Biosolutions | 23641 | Serial No.: D00384 |
| Microplate Washer Dispenser | BioTek | Unspecified | Model: EL406 |
| High-Content Imaging System (CellVoyager ) | Yokogawa Electric Corporation | Unspecified | Model: CV7000 |
| Orange G | New England Biolabs | B7022S | |
| TrypLE™ Express recombinant cell dissociation reagent | Thermo Fisher Scientific | 12604021 | Phenol red free |
References
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