Fordampning reduserende Kultur Forhold Øker reproduserbarhet av Flercellede spheroid Dannelse i mikrotiterplater
Summary
Den ujevne tap av medium fra mikrotiterplater påvirker reproduserbarheten av ensartet flercellet tumorcelleklump formasjonen. Forbedring av kulturbetingelser for å redusere betydelig medium tap vil forbedre reproduserbarheten av sfæroide formasjon og resultatene av sfæroide baserte analyser ved hjelp av væske-overlegg teknikk.
Abstract
Tumormodeller som tett etterligne in vivo forhold blir stadig mer populært i medisiner og utvikling for screening av potensielle anti-kreft narkotika. Flercellede tumor kuler (MCTSes) effektivt etterligne de fysiologiske betingelsene for solide tumorer, noe som gjør dem utmerket in vitro modeller for bly optimalisering og målet validering. Ut av de forskjellige teknikker som er tilgjengelige for MCTS kultur, væske-overlegg metoden på agarose er en av de mest rimelige metoder for MCTS generasjon. Imidlertid kan pålitelig overføring av MCTS kulturer ved hjelp av væske-overlegg for high-throughput screening bli svekket av en rekke begrensninger, blant annet belegg av mikrotiterplater (MPS) med agarose og ureproduserbarhet av ensartet MCTS formasjon på tvers av brønner. MP'er er vesentlig utsatt for kanteffekter som følge av overdreven fordampning av medium fra utsiden av platen, noe som forhindrer bruken av hele platen for medikamenttester. Dette manuskriptet inneholder detaljerte tekniske forbedringer i væske overlegg teknikk for å øke skalerbarhet og reproduserbarhet av uniform MCTS formasjon. I tillegg detaljer om en enkel, semi-automatisk, og universelt anvendelig verktøy for evaluering av MCTS har etter behandling er presentert.
Introduction
Kreftceller i tumorer er fysiologisk anordnet i en kompleks, 3-dimensjonal (3D) struktur omgitt av ekstracellulær matriks og samvirkende celler. Da nesten alle celler i vev befinner seg i et 3D-miljø, har behovet for mer fysiologisk relevant in vitro tumormodeller som etterligner tumor trekk resulterte i utviklingen av flere 3D-kulturteknikker 1, 2, 3. Disse modellene blir nå de grunnleggende forskning verktøy for å studere rollen til svulsten mikromiljøet på metastase og celle respons på terapeutika i 3D-2. Videre, sammenlignet med to-dimensjonale (2D) cellekulturer 4, 3D-modeller gir mulighet for en bedre forståelse av tumor-stroma interaksjoner, som påvirker cellesignalveier.
Flercellede tumor kuler (MCTSes) av kreftcellelinjer brukes ofte i 3D-celle cruk modeller på grunn av deres relative nærhet til in vivo-tumorer. Ut av flere teknikker som er i bruk, har det væske-overlegg teknikk (LOT) av MCTS generasjon på agarose-belagte plater fått betydelig interesse for bly optimalisering og target validering 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Dette fremgår av de nyere studier som var vellykket i stand til å kjøre pilot skjermer av sammensatte bibliotekene i MCTS kulturer som bruker LOT 6, 7. Men vel å bra variasjon i MCTS morfologi og vekst som følge av fordampning-indusert ujevn tap av medium er vanlige hindringer som følger med MYE hjelp mikrotiterplater (MPS). Følgelig dannelsen av ikke-uniform MCTSes kompromitterer betydning og relevansav data fra farmakologiske forsøk 8, 12, 13. I tillegg til de problemer reproduserbarhet, et annet praktisk problem som påvirker LOT-baserte high-throughput-analyser er belegning av MPS med agarose ved bruk av automatisk væskedispenseringsenheter. Selv om doseringsenheten kan holdes oppvarmet for å hindre gelering av agarose, er tilstopping av tappe kassetten og slangen et potensielt problem for robotsystemer 6.
For å overvinne noen av disse utfordringene, har vi nylig utviklet noen modifikasjoner i mye for MCTS kultur åtte. Disse endringene er i hovedsak basert på mulige måter å forebygge ujevn medium tap fra parlamentsmedlemmene ved bruk av instrumenter som vanligvis finnes i high-throughput screening laboratorier. En detaljert fremgangsmåte av den modifiserte LOT for generering av jevn størrelse og reproduserbare MCTSes på tvers av tre84-brønners plater (WPS) er presentert her. Manuskriptet presenterer også en semi-automatisert rutine for evaluering av MCTS størrelse, særlig i delvis desintegrerte, medikamentbehandlede MCTSes som ikke har et klart definert grense for måling av tverrsnittsarealet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Belegg 384-Well TC plater med filtrert Agarose
Den standard praksis i LOT er å bruke en 1-1,5% lavt smeltepunkt agarose for å belegge platene, som krever agarose og / eller dispenseringsenhet som skal holdes oppvarmet for å hindre geldannelse av agarose 6. Den gelering av agarose er av potensiell interesse, mens fremstilling av flere plater ved hjelp av væskedispenserende kassetter med små åpninger rør som strekker seg mellom 0,2 og 0,4 mm i diameter. For å overv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra den tsjekkiske Ministry of Education, Youth og Sport (LO1304) og Teknologisk Agency i Tsjekkia (TE01020028). Forfatterne ønsker å takke dr Lakshman Varanasi for å ta stillbilder av miljølokk.
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Low-melting |
| McCOY's 5A Medium | Sigma-Aldrich | M8403 | |
| “rapid” Filtermax filter | TPP | 99505 | 0.22 μm, 500 mL |
| Multidrop™ Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | |
| Small Tube Dispensing cassette | Thermo Fisher Scientific | 24073295 | Metal tip |
| 384-well TC plate | PerkinElmer | 6057308 | Plate type- CellCarrier |
| Standard Tube Dispensing Cassette | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | |
| MicroClime Environmental Lid | Labcyte | LLS-0310 | |
| DMSO | Sigma | D4540 | |
| Rotary Incubator (SteriStore ) | HighRes Biosolutions | 23641 | Serial No.: D00384 |
| Microplate Washer Dispenser | BioTek | Unspecified | Model: EL406 |
| High-Content Imaging System (CellVoyager ) | Yokogawa Electric Corporation | Unspecified | Model: CV7000 |
| Orange G | New England Biolabs | B7022S | |
| TrypLE™ Express recombinant cell dissociation reagent | Thermo Fisher Scientific | 12604021 | Phenol red free |
References
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
- Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening. Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).
- Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).
- Lao, Z., et al. Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells & Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA. PLoS ONE. 10 (7), e0133895 (2015).
- Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).
- Li, Q., et al. 3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen. J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).
- Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation. J. Biomol. Screen. , (2016).
- Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Sci. Rep. 17 (4), 3751 (2014).
- Solomon, M. A., Lemera, J., D’Souza, G. G. M. Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics. J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).
- Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).
- Walzl, A., et al. A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity. Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).
- Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays. Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci. Rep. 6, 19103 (2016).
- Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes. Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures. Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).
- Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically. J. Vis. Exp. (89), e51639 (2014).
