Summary
Die ungleichmäßige Verlust von Medium aus Mikrotiterplatten wirkt sich auf die Reproduzierbarkeit einheitlicher vielzelligen Tumor Sphäroidformation. Kulturbedingungen zu verbessern signifikant Medium Verlust zu reduzieren wird die Reproduzierbarkeit der Sphäroidbildung und die Ergebnisse der Sphäroid basierenden Assays unter Verwendung der flüssig overlay-Technik verbessern.
Abstract
Tumormodellen , die eng in - vivo - Bedingungen nachahmen werden immer beliebter in der Wirkstoffforschung und Entwicklung für das Screening von potenziellen Anti-Krebs - Medikamente. Vielzellige Tumorsphäroide (MCTSes) effektiv die physiologischen Bedingungen von soliden Tumoren zu imitieren, so dass sie eine ausgezeichnete In - vitro - Modelle für die Lead - Optimierung und Target - Validierung zu machen. Von den verschiedenen Techniken zur Verfügung, für MCTS Kultur, die Flüssig-Overlay-Verfahren auf Agarose ist eine der preiswertesten Methoden zur MCTS-Generation. Jedoch ist die zuverlässige Übertragung von MCTS-Kulturen unter Verwendung von Flüssig-Overlay für Hochdurchsatz-Screening durch eine Reihe von Einschränkungen beeinträchtigt werden, einschließlich der Beschichtung von Mikrotiterplatten (MPs) mit Agarose und die Nichtreproduzierbarkeit einheitlicher MCTS Bildung über Vertiefungen können. Abgeordnete sind deutlich anfälliger Auswirkungen auf Kante, die durch übermäßige Verdunstung des Mediums von der Außenseite der Platte führen, für Arzneimittel, die Verwendung der gesamten Platte zu verhindernTests. Dieses Manuskript enthält detaillierte technische Verbesserungen an der Flüssig-Overlay-Technik, um die Skalierbarkeit und Reproduzierbarkeit einheitlicher MCTS Bildung zu erhöhen. Zusätzlich Details zu einem einfachen, halbautomatische und universell einsetzbare Software-Tool zur Auswertung von MCTS verfügt nach der Arzneimittelbehandlung präsentiert wird.
Introduction
Krebszellen in Tumoren sind physiologisch in einem Komplex, 3-dimensionale (3D) Struktur, die durch extrazelluläre Matrix und die Interaktion Zellen umgeben angeordnet ist. Da fast alle Zellen in Geweben in einer 3D - Umgebung befinden, hat sich die Notwendigkeit für mehr physiologisch relevanten in vitro - Tumormodellen , die Tumormerkmale nachahmen 3 in der Entwicklung mehrerer 3D - Kulturtechniken 1, 2 geführt. Diese Modelle werden nun die Grundlagenforschung Werkzeuge für die Untersuchung der Rolle des Tumor - Mikroumgebung auf die Metastasierung und Zellantwort auf Therapeutika in 3D 2. Darüber hinaus, im Vergleich zu 2-dimensionale (2D) 4 - Zellkulturen erlauben 3D - Modelle für ein besseres Verständnis der Tumor-Stroma - Wechselwirkungen, die Zellsignalwege beeinflussen.
Vielzellige Tumorsphäroide (MCTSes) von Krebszelllinien werden häufig in 3D-Zelle c verwendetulture Modelle aufgrund ihrer relativen Nähe zu in vivo Tumoren. Von den verschiedenen Techniken in Gebrauch, die Flüssigkeit-overlay - Technik (LOT) des MCTS Generation auf Agarose-beschichteten Platten hat erhebliches Interesse für Lead - Optimierung und Target - Validierung 5 gewonnen, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Dies ergibt sich aus den jüngsten Studien , die erfolgreich in der Lage waren Pilot Bildschirme von Substanzbibliotheken in MCTS Kulturen 7 mit LOT 6, zu laufen. Doch auch zu gut Variabilität in MCTS Morphologie und das Wachstum durch die Verdunstung induzierte uneben Medienverlust sind häufig Hürden, die die LOT mit Mikrotiterplatten (MPs) begleiten. Folglich beeinträchtigt die Bildung von ungleichmäßigen MCTSes die Bedeutung und Relevanzvon Daten aus pharmakologischen Assays 8, 12, 13. Zusätzlich zu den Reproduzierbarkeit Fragen, ein weiteres praktisches Problem, das LOT-basierte Assays mit hohem Durchsatz beeinflusst, ist die Beschichtung der MPs mit Agarose, wenn die automatische Flüssigkeitsabgabeeinheiten verwendet wird. Obwohl die Abgabeeinheit erhitzt gehalten werden kann , das Gelieren von Agarose zu verhindern, ist das Verstopfen der Ausgabekassette und Schläuche ein potenzielles Problem für Robotersysteme 6.
Um einige dieser Herausforderungen zu bewältigen, haben wir vor kurzem ein paar Änderungen in der LOT für MCTS Kultur 8 entwickelt. Diese Modifikationen werden hauptsächlich auf mögliche Wege zu einer ungleichmäßigen Medium Verlust zu verhindern von den Abgeordneten mit Hilfe von Instrumenten, die zu finden sind, in Hochdurchsatz-Screening-Labors. Eine detaillierte Prozedur des modifizierten LOT für die Erzeugung von gleichmäßiger Größe und reproduzierbaren MCTSes über 384-Well-Platten (WPs) wird hier vorgestellt. Das Manuskript stellt auch eine halbautomatische Routine zur Auswertung von MCTS Größe, insbesondere in teilweise zersetzten, arzneimittelbehandelten MCTSes, die für die Messung der Querschnittsfläche keine klar definierte Grenze aufweisen.
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Protocol
1. Herstellung von Agarose-beschichteten Platten
- Man wiegt 0,75 g mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose und fügen Sie ihn in 100 ml McCoy 5A Medium (mit oder ohne Phenol rot) ohne Serum. Die Lösung wird in einer Mikrowelle und wirbeln alle 1-2 min vollständig die Agarose aufzulösen. Autoclave die Lösung um sie zu sterilisieren.
- Kühlen Sie die autoklaviert Agarose auf etwa 70 ° C und filtern sie durch einen 500 ml, 0,22 & mgr; m-Filter oben durch Vakuumfiltration in einem Laminar-Flow-Box. Aliquot der 0,75% gefiltert Agarose-Lösung (FAS) in kleineren Mengen, wenn nicht die gesamte Lösung sofort verwenden. Bewahren Sie diese ready-to-use Agarose-Lösung aseptisch in einem kalten Raum oder 4 ° C Kühlschrank für bis zu 4 Wochen.
- Bringen Sie ein kleines Röhrchen mit einem Plastik- oder Metallbestückte Abgabe Kassette an einen Combi-Reagenzspender und grundieren die Kassette mit 70% Ethanol (EtOH) und dann mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in einem Strömungsfeld.
- Vor der Verwendung erwärmen, um eine gespeicherte aliquote Menge von FAS i n die Mikrowellen es zu schmelzen. Prime die Abgabekassette mit Agarose-Lösung und Mantel 384-Well-Gewebekultur (TC) -behandelten "special" Mikrotiterplatten mit 15 & mgr; l von FAS. Lassen Sie die Agarose in der Platte für 15-20 Minuten abkühlen lassen, bevor die Zellen Aussaat. Lagern Sie die Agarose-beschichteten Platten aseptisch, in einem Polyethylenbeutel in einem kalten Raum eingewickelt oder bei 4 ° C und vor direktem Licht.
HINWEIS: Vermeiden wiederholter Erwärmung der 0,75% FAS eine Änderung in der Konzentration der Agarose in der Stammlösung zu verhindern. Agarose-beschichteten Platten können für bis zu 2 Wochen gelagert werden, wenn sie unter den oben genannten Bedingungen gelagert. Die FAS erfordert keine Erwärmung während der Beschichtung von Platten. - Reinigen Sie die Abgabekassette indem sie sie mit 70-80 ° C steriles Wasser Grundierung alle verbleibenden Agarose in den Kassettenspitzen und Schläuche zu entfernen.
2. Zellkultur und MCTS Formation
- Kultur menschlicher Zellen HCT116 kolorektalen Karzinomen, wie zuvor beschrieben,lass = "xref"> 8.
- Entfernen Sie die erforderliche Anzahl von Agarose-beschichteten, 384er, TC-behandelten Mikrotiterplatten von Kühl- und äquilibrieren sie auf Raumtemperatur (RT) für 15 min.
- Bereiten Sie den Combi-Reagenz Spender für Zellbesiedelung durch eine Standard-Rohrabgabekassette mit 70% EtOH und sterilem PBS Grundierung. Stellen Sie die Aussaat Volumen auf die erforderliche ul und die Abgabegeschwindigkeit zu Medium, um die manuelle Einstellung Tasten auf dem Dispenser.
HINWEIS: Die gesamte Zelle seeding Verfahren wird unter sterilen Bedingungen durchgeführt und in einer Laminar-Flow-Box. - Dissoziieren adhärenten Zellen von der Gewebekulturflasche ein rekombinantes zell Dissoziation Enzym verwendet. Machen Sie eine Zellsuspension Lager in einem sterilen Becher mit Samenzellen in einer Dichte von 2,5 x 10 4 Zellen / ml pro Vertiefung in 50 & mgr; l komplettem Wachstumsmedium. Wenn mehr als ein 384-WP Säen, rühren die Zellen einen Magnetrührer mit ihnen auf den Boden des Becherglases absetzen zu verhindern.
- Lassen Sie diePlatten für 30 min bei RT und dann zentrifugieren für 15 min bei 4 x g zu liegen kommt.
- Inzwischen nehmen eine Verdampfungsmindernden Umwelt Deckel und füllen Sie es mit 8 ml sterilem H 2 O oder 5% Dimethylsulfoxid (DMSO) in den kurzen Seiten (links und rechts) mit einer 5 - ml - Pipette (1A). Zunächst verzichtet werden 4 ml durch Fegen der Pipettenspitze langsam nach oben und unten Flüssigkeit in die linksseitige Wanne zu füllen. Wiederholen Sie diesen Schritt mit dem rechten Trog.
HINWEIS: Stellen Sie sicher , dass die Flüssigkeit zu den Seitenrinnen hinzugefügt verschmelzen nicht in der Mitte des Deckels, und lassen Sie eine Lücke für den Gasaustausch (1A). Zugabe einer überschüssigen Menge an H 2 O ergibt die Versickerung von H 2 O zu der Außenseite des Deckels und anschließend in die äußeren Vertiefungen der 384-Well - Platten TC. - Füllen Sie den Flüssigkeitsbehälter des 384-Well - TC Platte mit sterilem H 2 O und ersetzen die regulären Platte Deckel mit den flüssigkeitsgefüllten Umwelt Deckel (2A).
- Legen Sie die Platten in einem 37 ° C Inkubator Rotations mit 95% Feuchtigkeit, 5% CO 2 und 20% O 2 und damit die Zellen in MCTSes für 4 Tage zu aggregieren. Vermeiden Sie den Inkubator Tür öffnen zu lange in den folgenden Tagen, um das Feuchtigkeitsniveau absinkt abrupt zu verhindern.
3. Trägeraustausch ein Robotersystem verwenden
- Am Tag 4 folgende MCTS Bildung, fügen Sie 30 ul vorgewärmte Medium pro Vertiefung eines automatisierten Mikrotiterplatten-Waschspender verwenden. Lassen Sie die MCTSes für weitere 3 Tage wachsen. Ersetzen Sie das Medium regelmäßig alle 3 Tage, bis sie die gewünschte Größe für Experimente erreichen.
- Um aus jeder Vertiefung ein definiertes Volumen des Mediums aspirieren, empirisch die z -Höhe der Scheibe vielfältig anpassen. Absaugen 30 ul Medium pro Vertiefung und ersetzen Sie es mit 30 ul frisch, vorgewärmte Medium.
HINWEIS: Stellen Sie die Abgabegeschwindigkeit und die Geschwindigkeit, mit der die Scheibe Verteiler nach unten bewegtin Vertiefungen mit der niedrigsten Rate Turbulenz in den Vertiefungen zu minimieren.
4. Hoch Inhalt Imaging von MCTS und halbautomatische Bildanalyse
- Bild der MCTS in einem High-Content-automatisierten Abbildungssystem ein 4X Luftziel mit (NA 16).
- Stellen Sie die Belichtungszeit auf 11 ms und die Binning bis 4 x 4. Passen Sie die Anzahl und der Abstand der z -stacks und das Pixel - Binning wie für das Experiment gewünscht , ein ganzes MCTS pro Vertiefung zu erfassen.
- Verarbeiten Sie die Bilder schrittweise, wie in der beschriebenen "Readme" über eine eigene Routine in Programmiersprache geschrieben.
HINWEIS: Die .m Code und .txt Readme - Dateien sind als Zusatz - Code - Dateien (Abbildung 1B). Die Routine misst die MCTS-Bereich, Haupt- und Nebenachsen, Umfang und Festigkeit aus den 2D-Bildern.
Abbildung 1:Herstellung von Umwelt Deckel und ein Flussdiagramm der halbautomatischen Routine. (A) Bild eines Verdampfungsmindernden Umwelt Deckel gefüllt mit der richtigen (links) und Überschuss (rechts) Menge an Flüssigkeit füllen (hier 5% DMSO). Der Pfeil zeigt die Kurzseiten-Trog für das Hinzufügen von Flüssigkeit. Das Sternchen zeigt die Lücke in der Mitte des Deckels nach der Zugabe des korrekten Volumens von DMSO. (B) Ein Workflow zeigt die Schritte , die an der halbautomatischen Bildanalyseroutine. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Representative Results
Die ungleichmäßige Verlust von Medium, insbesondere aus dem peripheren Brunnen, ist ein häufig auftretendes Problem in MPs mit kleinen Kulturvolumina. Deutlich verbesserte Kulturbedingungen, wie Inkubatoren mit gut kontrollierten Temperatur- / Luftbefeuchtungssysteme und Verdunstung mindernde MPs und Platte Deckel, reduzieren 8 den erheblichen Verlust von Medium über Brunnen. Um die relative Verdunstung, gleiche Volumina von Orange G (OG) messen wurden in jede Vertiefung gegeben, und die Änderung der Absorption OG über 3 Tage wurde in Platten mit regelmäßigen und Umwelt Deckel in Standard- und Drehzentren aufgenommen. Plattenvertiefungen wurden in 6 Gruppen unterteilt auf der Grundlage ihrer Entfernung von der Kante der Platte (2A). In den Gruppen 1-4, gab es eine signifikante Veränderung in der Extinktion von OG über die Zeit in Platten mit regelmäßigen Deckeln in einem Standard - Inkubator (2B). Obwohl es auch eine Variation in der Absorption von OGGruppe 1 Vertiefungen in Platten unter den Umgebungsdeckel / drehbaren Inkubators Kombination (Abbildung 2C) wurden die Variationskoeffizienten (CVs) im Vergleich viel niedriger mit denen der Platten mit regelmäßigen Deckel in einem Standard - Inkubator (2D).
Die Verdunstung induzierte uneben Verlust des Mediums ist einer der möglichen Gründe für die gut-zu-gut Variabilität in MCTS Größe und Testanzeige in MPs 8. Jedoch 384er TC - Platten mit der Umgebungsdeckel / drehbaren Inkubators Kombination führte zur Bildung einheitlicher MCTSes über den 6 Gruppen von Vertiefungen (Figur 2E). Im Gegensatz dazu MCTSes in Platten mit dem regulären Deckel / Standard - Inkubator Kombination erheblich variieren in der Größe und Festigkeit (Abbildung 3F). Festigkeit ist ein Maß für MCTS Sphärizität und gibt den Grad der Zersetzung des MCTS. Die Festigkeit eines 2D-Bereich ist der Anteil der Pixel in dem convex Rumpf der Region von Interesse (ROI) und wird durch Dividieren der Fläche des ROI durch die Fläche der konvexen Hülle des ROI bestimmt. Beide Kreis und elliptische Regionen haben eine Festigkeit von 1, und als die MCTS zerfällt, die Festigkeit abnimmt. Der Unterschied in der Fläche bereits in Das et al. (2016) 8. Das Volumen wurde aus den Haupt- und Nebenachsen der MCTSes berechnet.
Abbildung 2: Die Platten mit minimaler Verdunstung zu einer erhöhten MCTS Reproduzierbarkeit. (A) Eine Platte Karte präsentiert die Aufteilung der Brunnen in 6 Gruppen zu zeigen. (B und C) Es gibt eine signifikante zeitabhängige Veränderung in der relativen Extinktion von OG von Vertiefungen in Gruppen 1-4 in Platten kultiviert , in einem Standard - Inkubator mit regelmäßigen Deckel (B) und aus der Gruppe 1 wirlls in Platten mit Umwelt Deckel in einem drehbaren Inkubators (C). Tag 3-5 OG Absorptionen sind normiert auf Tag 0 (D) Gemittelt Lebensläufe der OG Absorption der Gruppe 1 Brunnen von den Tagen 3-5 sind für die beiden Plattenkombinationen Deckel / Inkubator gezeigt. Lebensläufe sind Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten. (E) MCTSes in Platten mit dem Umweltdeckel / drehbaren Inkubators Kombination unterschied sich nicht signifikant über den 6 Gruppen von Vertiefungen gebildet. (B) jedoch Platten mit regelmäßigen Deckel in einem Standard - Inkubator gebildet MCTSes variabler Größe. Die Daten werden für n> 60 MCTSes pro Gruppe gezeigt. Die Boxen und horizontale Balken innerhalb der Felder in den Boxplots repräsentieren die 25. und 75. Perzentile und des Medianwertes sind. Die Whisker stellen die 5. und 95. Perzentile und die Ausreißer werden durch die ausgerichteten schwarzen Punkte in den Boxplots angezeigt. Die p-Werte des Kruskal-Wallis-Analyse sind unten dargestellt each boxplot. Die Daten werden von mindestens drei unabhängigen Experimenten pro Platte Deckel / Inkubator Kombination. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Um die potentielle Anwendbarkeit der Routine, 7 Tage alten MCTSes wurden mit Paclitaxel (PTX), Vincristin (VCR), Oxaliplatin (OXA), Doxorubicin (DOX) behandelt und 5-flurouracil (5-FU) in 3 verschiedenen Konzentrationen bestimmen, für 4 Tage. Die Medikamente wurden von der Universitätsklinik Olomouc, Palacký-Universität erhalten. Die MCTS Bilder wurden dann analysiert, und die Fläche, Haupt- und Nebenachsen, Umfang und Festigkeit der behandelten MCTSes wurden im Vergleich zu den Kontrollen (CTLs). Die Haupt- und Nebenachsen wurden verwendet, um die geometrische Volumen zu berechnen. Es gab eine konzentrationsabhängige Abnahme der MCTS Fläche und das Volumen nach der Arzneimittelbehandlung (Abbildung 3). Obwohl 0,001 & mgr; g / mL VCR und 0,4 ug / ml DOX und 5-FU führte zu einer Erhöhung der MCTS-Bereich wurde das Volumen nur signifikant erhöht folgenden 0,001 ug / ml VCR. MCTS Umfang unterschied sich signifikant nur bei den höchsten Konzentrationen von PTX, DOX und 5-FU, die vollständig den MCTS Größe betroffen. PTX und VCR bei 0,25 ug / ml und 0,06 ug / ml und DOX und 5-FU bei 100 ug / ml führte zu einer signifikanten Abnahme der Festigkeit, eine komplett zu partiellen Desintegration der MCTSes (Abbildung 3) anzeigt.
Abbildung 3: Messen von Arzneimittelwirkungen in MCTSes durch die halbautomatische Routine. (A) Bilder von CTL und Arzneimittel behandelten MCTSes vorgestellt. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Konzentrationen in ug / ml werden für jedes Bild gegeben. (B) Die Balkendiagramme zeigen eine dosisabhängige Wirkung von PTX, VCR, OXA, DOX, und 5-FU auf dieFläche und das Volumen von 7 Tage alten MCTSes folgenden 4 Tagen der Behandlung. MCTS Umfänge signifikant reduziert folgende 0,25 ug / ml PTX und 100 ug / ml DOX und 5-FU. Die Arzneimittelkonzentrationen, die in der komplett zu teilweisen Zerfall von MCTSes führte deutlich reduziert Solidität MCTS im Vergleich zu CTL. Die Daten sind die Mittelwerte ± SD von mindestens 5 MCTSes von 3 unabhängigen Platten. * p <0,001, # p <0,01, φ p <0,05 Medikament behandelten im Vergleich zu CTL, one-way ANOVA mit mehreren Vergleichstest des Dunnett. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Beschichtung 384-Well TC Platten mit Filtered Agarose
Die gängige Praxis in LOT ist ein 1-1,5% niedrig schmelzender Agarose zu beschichten , um die Platten zu verwenden, die die Agarose und / oder Abgabeeinheit erfordert gehalten werden erhitzt , um die Gelierung der Agarose 6 zu verhindern. Das Gelieren der Agarose ist potenziell besorgniserregende, während mehrere Platten unter Verwendung von flüssigem Dispensierkassetten kleinen Schlauchöffnungen im Bereich zwischen 0,2 und 0,4 mm Durchmesser vor. Zur Überwindung wurde das Potenzial Problem der Verstopfung der Abgabekassetten, 0,75% FAS verwendet, da es während der Abgabe keine zusätzliche Heizung benötigt. Übrigens wurde auch beobachtet, dass eine 0,75% FAS nicht so schnell wie ungefilterte 1-1,5% nicht gelieren oder sogar 0,75% Agarose-Lösung. Mit 0,75% FAS, dauert es weniger als 35 s zu beschichten eine ganze TC Platte mit 384 Vertiefungen, ohne die Abgabekassette zu verstopfen. Die Kassette kann durch Priming mit erhitztem Wasser am Ende gereinigt werden, um restliche a zu entfernengarose, die die Spitzen verstopfen könnten, wenn die Kassette nicht in Gebrauch ist.
Umwelt Deckel und Rotary Incubator über regelmäßige Platte Deckel und Incubator
Die Verdampfung induzierter unebene Verlust des Mediums beeinflusst erheblich die Reproduzierbarkeit der einheitlichen MCTS Bildung und beeinträchtigt folglich die Ergebnisse der Tests 14. Überraschenderweise Gruppe 1 Vertiefungen 384-well Platten TC unter den Umgebungsdeckel / drehbaren Inkubators Kombination zeigte eine statistisch signifikante Veränderung in OG Extinktion (2C). Jedoch zeigt eine niedrige CV von OG - Absorption in der Gruppe 1 Brunnen , dass die Verdampfung in den äußeren Vertiefungen der 384-Well - Platten TC im Dreh Inkubator mit Umwelt Deckel ist nicht so exzessiv wie MCTS Wachstum (2D) zu beeinflussen. Dies ergibt sich aus der einheitlich großen MCTSes in Gruppe 1 Brunnen in Platten mit dem Umwelt-Deckel / Dreh Inkubator Kombination gebildet. Auch reduziert Verlustdes Mediums verhindert well-to-gut Variabilität bei der Arzneimitteltests von 384-Well - Platten TC kultiviert im Dreh Inkubator mit Umwelt Deckel 8.
Die vorgestellte Methode führt auch zu der Bildung von gleichförmigen MCTSes von einigen anderen Krebs- und Nicht-Krebs - Zelllinien 8. Da jedoch alle Zellen, die nicht von Natur können in MCTSes auf einem nicht haftenden Oberfläche aggregieren, ist dieses Verfahren viele nicht geeignet sein für andere Zelllinien, die nicht für die Reproduzierbarkeit von einheitlicher MCTS Bildung getestet. Zusätzlich wurde der Schwerpunkt vor allem auf die Verwendung einer fortschrittlichen Technologie-Inkubator in Verbindung mit Verdampfungsmindernde MPs und Deckel Platte die Reproduzierbarkeit der MCTS Bildung zu erhöhen. Eine andere billige und einfache Lösung , um die Reproduzierbarkeit der MCTS Bildung zu erhöhen , die Verwendung von Embryo-Grade - Mineralöl sein könnte und atmungsaktiv Bänder oder Membranen Abdichtung, die Verdunstung zu verhindern , sondern ermöglichen normale Gasaustausch 15. Obwohl Agarose zusätzliche Dicke fügt Böden an der Platte, die ein Hindernis für die High-Content-Imaging sein kann, durch Agarose-Boden ist die Schärfentiefe im Durchlicht-Bildgebung erzeugt nicht behindert die Ermittlung von MCTS Größe und Form nach der medikamentösen Behandlung. Aus diesem Grund wird das vorgestellte Verfahren von potenziellem Interesse sein, um Forscher Reproduzierbarkeit Fragen in der LOT von MCTS Kultur gegenüber.
Halbautomatische Bildanalyse Routine
Obwohl es viele halbautomatische / automatische Software für MCTS Bildanalyse sind, ist die Messung der Größen komplett zu teilweise zerfallenen MCTSes nach medikamentöse Behandlung anfällig für Fehler 16, 17. Im ersten Schritt der dargestellten Routine, die am besten fokussierte Bild aus dem Satz von z -stack Bilder durch die Berechnung der Norm des Gradienten des Bildes und die Auswahl der mit der größten 0.999 qua automatisch ausgewähltNTILE. Dies ist eine robuste und rauschunempfindliche Maß für das Maximum.
Als nächstes werden die dunkleren Grenzen abgeschnitten und die bearbeiteten Bilder werden in der ursprünglichen Auflösung in Portable Network Graphics-Format gespeichert. Dieses Verfahren reduziert die Gesamtgröße von 2,5 GB, aus Abbildung eines gesamten 384-Well, TC-behandelte Platte, auf etwa 100 MB. Anschließend wird das Zentrum des MCTS durch eine Faltung mit einem Rundfilter von benutzerdefinierten Radius gefunden (wir verwenden 20 Pixel; 4A). Eine klare lokale Minimum des gefilterten Bildes stellt die Position des Zentrums (4A). Bewegen von diesem Mittelpunkt in konzentrischen Ringen, die mittlere Grauwert, M, in jeder Schale in Abhängigkeit von der Schalenradius berechnet wird, Danach R., das erste (wesentliche) Maximum des numerischen Ableitung der Funktion M (R) ist gefunden (4B). Der Punkt M OPT dieses Maximums wird als der optimale Schwellenwert genommen, und das Bild ist svon Thresholding auf dieser Ebene egmented.
Der MCTS ist als die größte zentrale Segment des Bildes identifiziert. Dieses Verfahren funktioniert in der Regel besser als die Standard Schwellwerttechnik , weil es den MCTS Kern von der zerfallenden Teile zu trennen ist in der Lage , die von medikamentösen Behandlung (4C und 4D) oft zur Folge haben . Außerdem hier nahm der Ansatz macht die implizite Verwendung der Rundheitsgrad des MCTS. Einfache Thresholding Routinen oder Algorithmen , die auf aktiven Konturen basiert, beuten nicht die a - priori - Wissen , das ein kugelförmiges Objekt zu finden ist. Wenn die MCTS klar erkannt und abgegrenzt, ist die maximale M OPT klar und Single. Die Routine misst dann die Eigenschaften des MCTS, wie der Bereich, Haupt- und Nebenachsen, Umfang und Festigkeit der angepassten Ellipse und spart eine Vorschau des segmentierten Bildes. Wenn das Maximum ist nicht klar, und / oder wenn mehrere lokale Maxima vorhanden sind, ein PreBlick auf die vorgeschlagene Segmentierung wird in einen Korrekturordner gespeichert.
Im vorletzten Schritt, geht die Routine den Benutzer durch die Korrektur-Ordner manuell die vorgeschlagene Segmentierung anpassen, indem die Schwelle nach oben oder unten bewegen und einen polygonalen Bereich von Interesse Auswahl möglich redundanten Teile der Maske abzuschneiden. Nach dieser manuellen Korrektur, speichert die Routinemaßnahmen und die MCTS Eigenschaften, wie oben beschrieben.
Abbildung 4: Abbildung des Bildsegmentierungsverfahren. (A) Das Zentrum des MCTS ist mit einem grünen Sternchen gekennzeichnet. Ein Beispiel des Annulus wird in rot dargestellt. (B) Der mittlere Grauwert in jeder Schale wird als Funktion des Schalenradius (blaue Linie) aufgetragen. Die numerische Ableitung dieser Kurve berechnet (rote Linie). Die erste wesentliche maximum des numerischen Derivat (schwarzer Stern) gefunden. (C) Das resultierende korrekte Segmentierung des Bildes in den MCTS Kern und der Hintergrund mit den zerfall MCTS Teile. (D) Falsche Segmentierung erhalten durch Otsu-Verfahren. 4X Ziel; Maßstabsbalken = 500 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem tschechischen Ministerium für Bildung, Jugend und Sport (LO1304) und der Technischen Agentur der Tschechischen Republik (TE01020028) unterstützt. Die Autoren möchten sich für die Aufnahme von Standbildern von Umwelt Deckel Dr. Lakshman Varanasi zu danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Low-melting |
| McCOY's 5A Medium | Sigma-Aldrich | M8403 | |
| “rapid” Filtermax filter | TPP | 99505 | 0.22 μm, 500 mL |
| Multidrop™ Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | |
| Small Tube Dispensing cassette | Thermo Fisher Scientific | 24073295 | Metal tip |
| 384-well TC plate | PerkinElmer | 6057308 | Plate type- CellCarrier |
| Standard Tube Dispensing Cassette | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | |
| MicroClime Environmental Lid | Labcyte | LLS-0310 | |
| DMSO | Sigma | D4540 | |
| Rotary Incubator (SteriStore ) | HighRes Biosolutions | 23641 | Serial No.: D00384 |
| Microplate Washer Dispenser | BioTek | Unspecified | Model: EL406 |
| High-Content Imaging System (CellVoyager ) | Yokogawa Electric Corporation | Unspecified | Model: CV7000 |
| Orange G | New England Biolabs | B7022S | |
| TrypLE™ Express recombinant cell dissociation reagent | Thermo Fisher Scientific | 12604021 | Phenol red free |
References
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