Здесь мы описываем установку программного обеспечения, навигацию и анализ данных для пространственно и во время точного способа измерения тонизирующих и фазовые внеклеточные изменений глутамата в естественных условиях , используя связанные с ферментом микроэлектрода массивов (MEA).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Использование ферментных биосенсоров на основе измерить Тоник и фазовый глутамат в мышиных моделях болезни Альцгеймера
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Нейротрансмиттеров нарушения часто является ключевым компонентом заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), играет определенную роль в патологии, лежащей в основе болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, депрессии и тревоги. Традиционно, микродиализ был наиболее распространенным (хвалили) метод для изучения изменений нейротрансмиттеров, которые возникают в этих расстройствах. Но поскольку микродиализ имеет возможность измерять медленные изменения 1-20 минутных через большие участки ткани, имеет тот недостаток, инвазивность, потенциально разрушая внутренние соединения внутри мозга и возможностей медленной выборки. Относительно новый метод, массив микроэлектродов (МЭС), имеет многочисленные преимущества для измерения специфических изменений нейротрансмиттеров внутри дискретных областей головного мозга, как они происходят, что делает для пространственно и во время точного подхода. Кроме того, с помощью МЭС является минимально инвазивной, что позволяет для измерения нейротрансмиттерных изменений в естественных условиях. В нашей лаборатории, мы гаве был специально заинтересованы в изменении нейромедиатора, глутамат, связанный с патологией болезни Альцгеймера. Таким образом, способ, описанный здесь, был использован для оценки потенциальных нарушений гиппокампа в глутамате в трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера. Вкратце, метод, используемый включает в себя нанесение на несколько площадок микроэлектрода с ферментом очень селективным для нейротрансмиттер интереса и использования автореферентного сайтов для вычитания фонового шума и мешающих а. После того, как покрытие и калибровка, МЭУ может быть построена с помощью микропипетки и опускают в области мозга интереса с использованием стереотаксической устройства. При этом, способе, описанном включает обезболивающий RTG (TauP301L) 4510 мышей и с помощью стереотаксического устройства точно ориентировать подобласти (DG, СА1 и CA3) гиппокампа.
Введение
Измерение нейромедиаторов изменений в головном мозге является важным инструментом для нейробиологов, изучающих заболевания центральной нервной системы (ЦНС), которые часто характеризуется нейромедиатор дизрегуляция. Хотя микродиализ в сочетании с жидкостной хроматографией высоким давлени (ВЭЖЙ / EC) был наиболее широко используемым методом для измерения изменений внеклеточного уровня нейротрансмиттеров 1, 2, 3, 4, пространственное и временное разрешение микродиализных зондов может не быть идеальным для нейротрансмиттеров , такие как глутама....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Покрытие микроэлектрода массива с помощью ферментов или матричного слоя
- Подготовка матричного белка раствор
- Взвесить 10 мг бычьего сывороточного альбумина (BSA) и переносят в 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
- Добавить 985 мкл деионизованной воды в микроцентрифужных пробирку, содержащую БСА. Смешайте раствор путем ручного перемешивания (ре-пипеткой с помощью 1000 мкл пипетки ~ 3 раз, до тех пор пока БСА не растворится).
Примечание: Не используйте завихрения для смешивания раствора, как это может вводить воздух в раствор. Кроме того , установлено пипетку до объема <1000 мкл (например , 700 мкл) , чтобы из....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Несмотря на то, что эта технология может быть использована для измерения изменений в глутаматэргических сигнализациях во многих видах животных моделей, такие как черепно-мозговой травма, старение, стресс и эпилепсии, здесь мы покажем, как технология MEA может быть использована для изучения глутаматергических изменений в модели трансгенной мыши человеческой таупатии 19, 20. РТГ (TauP301L) 4510 мыши выражает мутацию P301L в тау, св.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Методика позволяет МЭС для измерения быстрой кинетики высвобождения нейротрансмиттеров и поглощения в пробирке и в естественных условиях. Таким образом, технология производит широкий спектр выходных данных, включая уровни нейромедиаторов тонизирующих, вызывали высвобождение нейротрансмиттеров и клиренс нейромедиаторов. Однако, поскольку использование МПС является относительно сложной процедурой, существует множество факторов, которые, возможно, должны быть оптимизированы для успешного использования. На.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
GG является единственным собственником Quanteon, LLC, которая делает FAST-16 систему записи, используемую для измерения глутамата в данном исследовании. JEQ является платным консультантом Quanteon.
Благодарности
Эта работа была поддержана Национальным институтом общих медицинских наук (НРД; U54GM104942), NIA (НРД; R15AG045812), Ассоциации Альцгеймера (МНР; NIRG-12-242187), WVU факультет Исследовательского Сенатской Гранта (НРД) и WVU PSCOR Гранта (МНР).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| FAST-16mkIII-8 канальный | Quanteon | 16mkIII | |
| Микроэлектродные матрицы | CenMet | W4 или 8-TRK | |
| Бычья сыворотка Альбумин (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 г (срок годности через 1 месяц) |
| Глутаральдегид | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 мл (срок годности 6 месяцев) |
| Глутаматоксидаза | US Biological или Sigma Aldrich | G4001-01 или 100646 | 50 UI (истекает через 6 месяцев) |
| Шприцы Hamilton | Hamilton | #80383 | 2 шприца |
| Метанол | BDH | UN1230 | 4 л |
| m-фенилендиамина дигидрохлорид (мФД) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 г |
| Электроды сравнения (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 электрода |
| Питание от батареи Магнитный пластина для перемешивания | Cole-parmer | EW-04804-01 | Можно приобрести у разных поставщиков |
| Глутамат | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 г |
| Аскорбиновая кислота | TCI | 50-81-7 | 500 г |
| Дофамина гидрохлорид | Альфа Аэсар | 62-31-7 | 5 г |
| Хлорная кислота | VWR | UN2920 | 500 мл |
| Постассиум хлорид | VWR | 7447-40-7 | 1 кг |
| натрия хлорида | VWR | 7647-40-7 | 1 кг |
| кальция хлорида | MP | 153502 | 100 г |
| натрия гидроксида | BDH | 1310732 | 500 г |
| Стеклянные пипетки под давлением | CenMet | ||
| Клейкий воск | Kerrlab | 625 | Можно приобрести у разных поставщиков |
| Микрошприц | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Пластилин для лепки | WalMart | Можно приобрести у разных поставщиков | |
| Picospritzer III | Parker | ||
| Silver wire | AM systems | # 786500 | |
| Соляная кислота | BDH | 7647010 | 2,5 л |
| Платиновая проволока | AM Systems | 778000 | |
| Паяльник | Lowes или Home Depot | Можно приобрести у разных поставщиков | |
| Мультиметр | WalMart | Можно приобрести у разных поставщиков | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | Можно приобрести у разных поставщиков | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | Можно приобрести у разных поставщиков | |
| Стереотаксическое устройство | Stoelting | Можно купить у разных поставщиков | |
| Digital Lab Standard | Stoelting | Можно приобрести у разных поставщиков | |
| Meiji EMZ микроскоп | Meiji | EMZ-5 | |
| Drill | Dremel | Micro | |
| Metricide | Metrex | 102800 | |
| Scalpel | VWR | Можно купить у другого поставщика | |
| Хирургические ножницы | VWR | Можно приобрести у разных поставщиков | |
| Стерильные ватные тампоны | Puritan | 25806 | Можно приобрести у разных поставщиков |
| Глазную мазь | Puralube Vet Ointment | Получить у ветеринара | |
| Йодные тампоны | VWR | S48050 | Можно приобрести у разных поставщиков |
| Спиртовые тампоны | Местная аптека | Можно приобрести у разных поставщиков | |
| Стерильная хирургическая простыня | Dynarex | 4410 | Можно приобрести у разных поставщиков |
| Стерильный физиологический раствор | Teknova | S5815 | Можно сделать собственный раствор с помощью фильтров |
| Перекись водорода (3%) | Местная аптека | Можно приобрести у разных поставщиков | |
| Грелка | WalMart | Можно приобрести у разных поставщик |
Ссылки
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Cavus, I., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
