Viral-derived peptider kopplade till antikropp-konjugat (ACs) är en metod att få fart på grund av potentialen för att leverera molekylär nyttolaster med ökad tumör cell ackumulering. Detta protokoll utnyttja gemensamma metoder för att utvärdera peptid konjugation, AC och nyttolast intracellulär ackumulation och tumör inriktning, och hjälper forskare under de viktiga första utvecklingsfaserna.
Antikropp-konjugat (ACs) modifierad med virus-derived peptider är en potentiellt kraftfulla klass av tumör cell leverans agenter för molekylär nyttolaster används vid cancerbehandling och imaging på grund av ökad cellulär ackumuleras över nuvarande ACs. Under tidiga AC in vitro- är utveckling, fluorescens tekniker och radioimmunoassays tillräckliga för att fastställa intracellulära lokalisering, ackumulering effektivitet och målet cellen specificitet. För närvarande finns det ingen konsensus om standardiserade metoder för att förbereda celler för att utvärdera AC intracellulär ackumulation och lokalisering. Den ursprungliga testning av ACs modifierad med virus-derived peptider är avgörande speciellt om flera kandidater har byggts. Att bestämma intracellulär ansamling av fluorescens kan påverkas av bakgrund signal från ACs på cellytan och komplicera tolkningen av ackumulering. För radioimmunoassays, vanligtvis behandlade cellerna är fractionated och radioaktiviteten i olika cell fack mätt. Dock cellys varierar från cell till cell och ofta kärnvapen och cytoplasmiska fack är inte tillräckligt isolerade. Detta kan ge missvisande uppgifter om nyttolast leverans egenskaper. Intravenös injektion av radiomärkt virus-derived peptid-modifierade ACs i tumör med möss följt av radionuklid imaging är en kraftfull metod för att bestämma tumör inriktning och nyttolast leverans egenskaper på den in-vivo -fasen av utveckling. Men detta är en relativt ny avancemang och några grupper har utvärderat virus-derived peptid-modifierade ACs på detta sätt. Vi beskriver behandlingen av behandlade cellerna att mer exakt bedöma virus-derived peptid-modifierade AC ackumulering när du använder konfokalmikroskopi och radioimmunoassays. Specifikt, bunden en metod för trypsinizing celler bort cellytan ACs. Vi ger också en metod för att förbättra cellulär fraktionering. Slutligen ger detta protokoll en in-vivo -Metod med hjälp av positronemissionstomografi (PET) för att utvärdera inledande tumör inriktning boenden i tumör-bärande möss. Vi använder den radioisotop 64Cu (t1/2 = 12,7 h) som ett exempel nyttolast i detta protokoll.
Antikropp-konjugat (ACs) är biologiska läkemedel som mognar till en omvälvande klass av effektiva läkemedel för att förbättra cancerbehandlingar och för att upptäcka tumörer. Består av en monoklonal antikropp (mAb) konjugerat till molekylär nyttolaster som radioisotoper, små molekyler och biologiska gifter, ACs kan leverera dessa nyttolaster till cancerceller med utsökta mål antigen affinitet och specificitet. ACs har därmed potential att avsevärt minska ospecifik toxicitet och ökar nyttolasten aktivitet på webbplatsen tumören. Terapeutiskt, har ACs transporterar cytotoxiska små molekyler (vanligen kallat antikropp-drogen konjugat) godkänts för behandling av patienter med bröstcancer och Hodgkins lymfom som har misslyckats med konventionella behandlingar 1, 2. Dessutom ACs transporterar radioisotoper (ofta kallad radioimmunoconjugates) är också under utveckling. En AC som transporterar en radioisotoper för avbildning är godkänd för att identifiera prostatacancer metastaser 3. Med många mer terapeutiska ACs inskickad för godkännande 4, är optimismen hög för framtiden för ACs att förbättra cancer care 5.
Ändå när leverera kemoterapeutika eller radioisotoper, ACs har svårigheter att effektivt ackumulera dessa nyttolaster inuti målceller. Denna aspekt bidrar avsevärt i många fall i oförmågan av ACs att ge långvarig överlevnad eller hög kontrast tumör imaging 6,7. I allmänhet när ACs binda deras mål antigen är de internaliserat genom en process som kallas receptormedierad endocytos. ACs är sedan anhållna inuti endosomes och människohandel till lysosomer för nedbrytning och nyttolast release 8. Intracellulära människohandel processen innebär utmaningar för ACs att uppnå en hög nyttolast specificitet och effekten mot cancer målceller. Exempelvis många antigener såsom Her2 (mål för terapeutiska AC Trastuzumab-emtansin) kan återvinna upp till 85% av bundna antikroppar i första 30 min 9. Dessutom när nedbrytningen sker, kan släppt kemoterapeutika och radioisotoper aktivt exporteras genom ökat uttryck eller aktivitet av membran associerade transport proteiner 10,11. Lysosomen nedbrytning hindrar också leverans av romanen biologiska nyttolaster såsom terapeutiska enzymer och oligonukleotider som kan avaktiveras 12,13. I huvudsak är cancercellen mycket effektivt på om upphävande av nödvändiga intracellulära ackumuleringen av nyttolaster levereras av ACs.
Det här protokollet beskriver hur du implementerar begreppet ACs-kopplat till virus-derived peptider, speciellt för fly endosome brottsprovokation och lokalisera till cellkärnan. Med sådan finess att manipulera cell värdsystem, är det inte förvånande att utvecklingen av virus-derived proteiner och peptider som potentiella biologiska läkemedel har länge varit ingrodd i terapeutisk forskning 14. Under miljontals år utvecklats virus för att förvärva en enastående samling av proteiner kan utnyttja normala fysiologiska däggdjursceller system för att effektivt ange värdceller. För virus som är internaliserad via receptormedierad endocytos, ifrågasätts de också utströmmande människohandel till Lysosomen där angrepp av en lokaliserad koncentration av proteaser kan vara problematiskt för överlevnad. En väl karakteriserade viral-derived peptid som utnyttjas i drogen leverans för flyr endosome entrapment är humant immunbristvirus transactivator transkription (Tat) protein 15. Tat är kunna fly endosome entrapment av avkänning låg-pH då protein konfirmerande förändringar inträffar möjliggörande Tat för att sätta sig in och störa den endosomal membran 16. Detta resulterar i Tat-nyttolast konjugat komma åt cytoplasman. Elementet för andra virala manipulation som relaterade till detta protokoll är det synsätt som används för att leverera terapeutiska gener och droger till nucleus 17. Virus har utvecklats framgångsrikt manipulera värd cell maskiner för framåt förbi det nukleära membranet genom att passera genom kärnkraft pore komplexa (NPC). Cellulära makromolekyler innehåller (eller binda till proteiner som innehåller) cellkärnelokalisering signaler (NLSs) nödvändiga för att binda till nukleära transport proteiner (t.ex. karyopherins α och β), som ger de nödvändiga rörelserna genom NPC. Virus har utvecklat proteiner innehåller NLS sekvenser som ger dem möjlighet att utnyttja värd cell transportproteiner för shuttling i nucleus 18.
Många ACs har tidigare functionalized med Tat – och NLS-härledda peptider och testats för deras förmåga att ackumulera inuti cancerceller och inriktning tumörer 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (tabell 1). Studier att leverera cytotoxiska nyttolaster har visat att ACs modifierad med virus-derived peptider har möjlighet att avsevärt öka cellulära ackumulering, cytotoxicitet och tumör döda över omodifierade ACS- 22,26. Ett gemensamt drag för denna nya klass av AC är deras konstruktion. Normalt innehåller peptider en terminal cystein som tillhandahåller en gratis sulfhydryl-grupp. MAbs är först reagerade med en noncleavable bifunktionell crosslinker som innehåller N– hydroxysuccinimide (NHS) och maleimide grupper i motsatta ändar. NHS estrar reagerar med primära aminer i mAb att bilda amide obligationer. De reagerade mAb med gratis maleimide grupper är då reagerade med sulfhydryl grupper på peptiderna bilda en thioester bond och därmed länka peptid och mAb. Även om homobifunctional bindemedel används 28, heterobifunctional crosslinker är mer allmänt används i byggandet av virus-derived peptid-ACs 22,23,26, 31,32. Detta protokoll speciellt använder den crosslinker sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyklohexan-1-bildas (sulfo-SMCC) för dess användarvänlighet och eftersom det används i den godkända antikropp-drogen konjugat Trastuzumab-emtansin och i många virus-derived peptid-ACS- 8,22,23,26,31,32. Sodium dodecyl sulfate polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) är den primära metoden för att inledningsvis fastställa konjugation effektivitet och semi kvantifiera antalet peptider per mAb. Konfokalmikroskopi använder en fluorescently-märkt sekundär antikropp specifik för mAb är vanligtvis metoden för att initialt bedöma intracellulär distribution egenskaperna för virus-derived peptid-modifierade ACs. Hittills har är radioisotoper de primära nyttolaster levereras av virus-derived peptid-modifierade ACs. Radioisotoper är fördelaktigt eftersom radioaktivitet i celler enkelt kvantifieras genom gamma räkning. Dessutom ACs som översätts till musmodeller av mänskliga cancerformer ger forskare möjlighet att utvärdera tumör inriktning med molekylär avbildningsmetoder såsom single photon emission beräknade datortomografi och positronemissionstomografi (PET) 23 , 32 , 33. I allmänhet konstruktion och validering testmetoder används främst av forskare ge en mycket bra bedömning av ACs modifierad med virus-derived peptider under inledande utvecklingsarbetet för att effektivt komma in och leverera den nyttolast inuti målceller och till målet tumörer.
Tat och NLS-modifierade ACs har belyst nyckelområden för att ytterligare förbättra nyttolast leverans inuti cancerceller och tumörer. När det gäller NLS-modifierade ACs, kan effektiviteten i intracellulär ansamling vara blygsamma 23,31,34. Ineffektiva intracellulär ansamling orsakas av fortsatt endosomal entrapment. In vivo tumör inriktning kan också minskas med båda Tat och NLS-modifierade ACs. Den aktiva sekvenser av Tat och NLS innehålla flera positivt laddade rester. När bifogas mAbs, vara övergripande katjoniska avgiften betydligt ökad 35. Som en följd har den Tat och NLS-modifierade ACs ökat upptag i friska vävnader och ökade snabbt blod clearance.
Vår grupp utvecklat en sammansatt förening bestående av cholsyra kopplade till NLS (ChAcNLS; (Se figur 1). ChAcNLS modifierade ACs kan öka intracellulära ackumuleringen av levererade radioisotoper och förbättra tumör inriktning jämfört med NLS-modifierat och traditionella ACs 33,34. Mekanismen bakom cholsyra är inspirerad av förmågan hos utvalda nonenveloped virus som inte kan åberopa membran fusion att utnyttja cholsyra för att utlösa endosome fly genom bildandet av ceramide. Exempelvis rekryterar svin enteriska virus cholsyra som aktiverar sphingomyelinase, katalyserar hydrolys av ceramidas in ceramide 36,37,38. Detta gör virus att fly och destabiliserar endosomal membran. Cholsyra är alltså en annan virus-derived komponent som kompletterar NLS.
När fältet rör sig framåt och framtida uppstår framsteg i nyttolast leverans av ACs modifierad med virus-derived peptider, är det ett lämpligt tillfälle att ge visuella demonstrationer av deras biokemiska och funktionella egenskaper under första utveckling. Här beskriver vi våra protokoll för den inledande utvärderingen av virus-derived peptid-modifierade ACs för effektiva och ändå enkel bestämning av intracellulär ackumulation och tumör inriktning under tidiga utvecklingsfaserna. Vi använder kommersiellt tillgängliga mAbs 7 g 3 och A14 som exempel modellsystem. Procedur 1 beskriver användningen av SDS-PAGE som en metod som möjliggör för ‘ go/no go’ beslut för konstruerade ACs. 2 beskrivs en metod med trypsinization möjliggör förbättrad visualisering av AC intracellulär distribution och ackumulering. 3 beskrivs en metod för förbättrad intracellulära fraktionering att noggrant bestämma cellkärnelokalisering. I den här proceduren använder vi den payload 64Cu (t1/2 = 12,7 h) eftersom den är sårbara för cellulära efflux och är en positron emitter 10. Således, procedur 4 beskriver i vivo tumör inriktning karakterisering av PET imaging för att visualisera tumören upptag i förhållande till bakgrunden (dvs ickemålorganismer friska vävnader) och avgöra huruvida exemplet AC kan specifikt och effektivt målet tumörer. Dessa metoder är tillräckliga för utredarna utveckla ACs modifierad med virus-derived peptider för att identifiera kandidater för vidare avancemang.
Stora målen systemisk leverans av anti-cancer är att öka ackumulering vid tumör webbplats och upptag inom cancerceller och minska oönskade biverkningar i friska vävnader. AC riktade leverans av molekylär nyttolaster till tumörceller är en mycket lovande metod att behandla och upptäcka tumörer. Men avsaknaden av effekt orsakas av endosome brottsprovokation och ner stream lysosomal nedbrytning förblir en viktig utmaning. Medan detta protokoll använder ChAcNLS peptiden som ett exempel för byggandet av nästa g…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av den Cancer Research Society (Kanada) och CIMS. Författarna tackar Dr. Samia Ait-Willy och Jean-Francois Beaudoin för hjälp. Dr. Angel Lopez (University of South Australia) för mAb A14.
Sulfo-SMCC | Thermo Scientific | 22122 | There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from. |
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters | EMD Millipore | UFC505096 | There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs. |
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | BioRad | 1610375EDU | Mulicolor recombinant proteins from 10-250 kDa. |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200056 | 100 or 500 mL volumes to choose from. |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Scientific | A-21235 | 1-10 μg/mL recommended |
NOTA-NHS | CheMatech | C100 | |
Lamin A/C antibody (N-18) | Santa Cruz Biotechnology | sc-6215 | |
Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-376362 | |
A14 mAb | BD Biosciences | 555902 | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0007 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-25ML | |
TF-1a cells | ATCC | ATCC CRL-2003 | |
RPMI 1640 medium | ATCC | ATCC 30-2001 | |
RIPA lysis and extraction buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
AMIDE medical imaging software | available at amide.sourceforge.net | Completely free download | |
FluoView FV1000 Confocal Microscope | Olympus | ||
Fluoview Software | Olympus | www.olympus-lifescience.com | |
ITLC strips | Biodex | 150-771 |