JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Bioengineering

Indledende vurdering af antistof-konjugater modificeret med Viral-afledte peptider til at øge cellulære ophobning og forbedring af Tumor målretning

Published: March 08, 2018
doi:
10.3791/55440
, , , , , ,
1Department of Nuclear Medicine and Radiobiology,Université de Sherbrooke, 2Sherbrooke Molecular Imaging Center (CIMS),Université de Sherbrooke, 3Sherbrooke Institute of Pharmacology

Summary

Viral-afledte peptider koblet til antistof-konjugater (ACs) er en tilgang vinder momentum på grund af potentialet for at levere molekylære nyttelast med øget tumor celle ophobning. Ved hjælp af fælles metoder til at vurdere peptid konjugering, AC og nyttelast intracellulære ophobning og tumor målretning, hjælper denne protokol forskere i de vigtige indledende udviklingsfaser.

Abstract

Antistof-konjugater (ACs) modificeret med virus-afledte peptider er en potentielt stærk klasse af tumor celle levering agenter for Molekylær nyttelast bruges i kræftbehandling og imaging på grund af øget cellulær ophobning over nuværende ACs. Under tidlig AC in vitro- er udvikling, fluorescens teknikker og radioimmunoassays tilstrækkelig for bestemmelse af intracellulære lokalisering, ophobning effektivitet og målet celle specificitet. I øjeblikket er der ikke enighed om standardiserede metoder for at forberede celler til evaluering af AC intracellulære ophobning og lokalisering. Den indledende testning af ACs modificeret med virus-afledte peptider er kritisk, især hvis flere kandidater har været konstrueret. Bestemmelse af intracellulære ophobning af fluorescens kan blive påvirket af baggrunden signal fra ACs på celleoverfladen og komplicere fortolkningen af ophobning. For radioimmunoassays, typisk behandlede celler er fraktioneret og radioaktivitet i forskellige celle rum målt. Men celle lysis varierer fra celle til celle og ofte nukleare og cytoplasmatisk rum er ikke tilstrækkeligt isoleret. Dette kan give vildledende oplysninger om nyttelast levering egenskaber. Intravenøs injektion af radiolabeled virus-afledte peptid-modificerede ACs i tumor forsynet med mus efterfulgt af radionuklid imaging er en kraftfuld metode til bestemmelse af tumor målretning og nyttelast levering egenskaber på i vivo fase af udvikling. Men dette er en forholdsvis ny fremgang og nogle grupper har evalueret virus-afledte peptid-modificerede ACs på denne måde. Vi beskriver behandlingen af behandlede celler mere præcist vurdere virus-afledte peptid-modificerede AC ophobning, når du bruger Konfokal mikroskopi og radioimmunoassays. Specifikt, bundet en metode til trypsinizing celler til at fjerne celleoverfladen ACs. Vi tilbyder også en metode til forbedring af cellulære fraktionering. Endelig giver denne protokol en i vivo metode ved hjælp af positron emissions tomografi (PET) for at vurdere oprindelige tumor målretning egenskaber i tumor-bærende mus. Vi bruger radioisotop 64Cu (t1/2 = 12,7 h) som et eksempel nyttelast i denne protokol.

Introduction

Antistof-konjugater (ACs) er biopharmaceuticals, der modning i en transformativ klasse af effektive lægemidler til at forbedre kræftbehandling og til påvisning af tumorer. Består af et monoklonalt antistof (mAb) konjugeret til molekylære nyttelast som radioisotoper, små molekyler og biologiske toksiner, ACs er i stand til at levere disse payloads til kræftceller med udsøgte mål antigen affinitet og specificitet. Dermed ACs har potentiale til at reducere uspecifik toksicitet og øge nyttelasten aktivitet på webstedet tumor. Terapeutisk, er ACs transport af cytotoksiske små molekyler (ofte refereret til som antistof-drug konjugater) blevet godkendt til behandling af patienter med brystkræft og Hodgkins lymfom, som ikke har konventionelle behandlinger 1, 2. Derudover ACs transport af radioaktive isotoper (ofte kaldet radioimmunoconjugates) er også under udvikling. En AC transporterer en radioisotop for billedbehandling er godkendt til at identificere prostata kræft metastaser 3. Med mange mere terapeutisk ACs forelægges til godkendelse 4, er optimisme høj for fremtiden i ACs at forbedre kræft pleje 5.

Ikke desto mindre, når levere kemoterapeutika eller radioisotoper, ACs har svært ved effektivt akkumulere disse nyttelast inde i target-cellerne. Dette aspekt bidrager betydeligt i mange tilfælde i den manglende evne til i ACs at give langvarig sygdomsfri overlevelse eller høj kontrast tumor imaging 6,7. I almindelighed, når ACs binde deres mål antigener er de internaliseres gennem en proces kendt som receptor-medieret endocytose. ACs er derefter fanget inde i endosomes og smugles til lysosomer for nedbrydning og nyttelast frigive 8. Den intracellulære menneskehandel proces giver udfordringer for ACs opnår høje nyttelast specificitet og effekten mod målrette kræftceller. For eksempel, mange antigener såsom Her2 (mål for terapeutisk AC Trastuzumab-emtansine) kan genbruge op til 85% af bundne antistoffer i de første 30 min. 9. Desuden, når nedbrydning sker, frigivne kemoterapeutika og radioisotoper kan aktivt eksporteres af øget udtryk og/eller aktivitet af membran forbundet transport proteiner 10,11. Lysosomet nedbrydning også hindrer levering af nye biologiske nyttelast som terapeutisk enzymer og oligonukleotider, der kan være deaktiveret 12,13. I det væsentlige, er kræftcellen meget effektive på om ophævelse af den nødvendige intracellulære ophobning af nyttelast leveret af ACs.

Denne protokol beskriver, hvordan du implementerer begrebet ACs-koblet til virus-afledte peptider, specielt til undslippe endosome fastklemning og lokalisering til cellekernen. Med sådanne raffinement at manipulere værtssystemer celle, er det ikke overraskende, at udviklingen af virus-afledte proteiner og peptider som potentielle biopharmaceuticals længe har været indgroet i terapeutisk forskning 14. Angiv værtsceller for millioner af år virus har udviklet sig til at erhverve en enestående samling af proteiner kan udnytte normale fysiologiske pattedyr celle systemer til effektivt. For vira, som er internaliseret via receptor-medieret endocytose, er de også udfordret med flygter handel til lysosomet hvor stormløb af en lokaliseret koncentration af proteaser kan være problematisk for overlevelse. En vel karakteriseret viral-afledte peptid udnyttes i medicinafgivelse for undslippe endosome fastklemning er human immundefekt virus transaktivatoren transskription (Tat) protein 15. Tat er stand til at undslippe endosome fastklemning af sensing lav-pH på hvilket tidspunkt sker protein konformationelle ændringer aktivering Tat for at indsætte sig selv ind og forstyrre endosomal membran 16. Dette resulterer i Tat-nyttelast konjugater kan få adgang til cytoplasma. Den anden viral manipulation element, der vedrører denne protokol er den fremgangsmåde, der anvendes til at levere terapeutiske gener og narkotika til kernen 17. Virus har udviklet sig til at kunne manipulere vært celle maskiner til går forbi Kernemembranen ved at passere gennem den nukleare pore komplekse (NPC). Cellulære makromolekyler indeholder (eller binder sig til proteiner, der indeholder) nukleare lokalisering signaler (NLSs) nødvendige for bindende til nukleare transport proteiner (f.eks. karyopherins α og β), som giver de nødvendige bevægelser gennem NPC. Virus har udviklet proteiner til at indeholde NLS-sekvenser, der giver dem mulighed for at udnytte vært celle transport proteiner for shuttling i nucleus 18.

Talrige ACs har tidligere været functionalized med Tat – og NLS-afledte peptider og testet for deres evne til at ophobes inde i kræftcellerne og for målretning tumorer 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (tabel 1). Undersøgelser levere cytotoksiske nyttelast viste, at ACs modificeret med virus-afledte peptider er stand til at øge cellulære ophobning, cytotoksicitet og tumor dræbe over umodificeret ACs 22,26. Et fælles træk for denne roman klasse af AC er deres konstruktion. Typisk, peptider indeholde en terminal cystein giver en gratis sulfhydryl gruppe. MAbs er først reagerede med en noncleavable bifunctional crosslinker som indeholder N– hydroxysuccinimide (NHS) og maleimide grupper i modsatte ender. NHS estere reagere med primære aminer på mAb at danne akrylamid obligationer. Den monomers mAb med gratis maleimide grupper er derefter reagerede med sulfhydryl grupper på peptider til at danne et thioester bånd og dermed forbinder peptid og mAb. Selv om homobifunctional overfladebehandlingsvæsker har været brugt 28, heterobifunctional crosslinker er mere almindeligt anvendt i opbygningen af virus-afledte peptid-ACs 22,23,26, 31,32. Denne protokol bruger specifikt crosslinker sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyklohexan-1-carboxylat (sulfo-Investeringsfondene) for sin brugervenlighed og fordi det er brugt i den godkendte antistof-drug konjugat Trastuzumab-emtansine og i mange virus-afledte peptid-ACs 8,22,23,26,31,32. Sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) er den primære metode for i første omgang konstatering konjugation effektivitet og semi-kvantificere antallet af peptider pr. mAb. Konfokal mikroskopi ved hjælp af en fluorescently mærket sekundær antistof specifikke til mAb er typisk metode til i første omgang evaluering af intracellulær distribution egenskaber af virus-afledte peptid-modificerede ACs. Hidtil er radioisotoper de primære nyttelast leveret af virus-afledte peptid-modificerede ACs. Radioisotoper er fordelagtig, fordi radioaktivitet i celler er nemt kvantificeres ved gamma optælling. Derudover ACs, der er oversat til musemodeller af menneskelige kræftformer giver forskere mulighed for at evaluere tumor målretning ved hjælp af molekylær billeddannelse modaliteter som single photon emission beregnet tomografi og positron emission tomografi (PET) 23 , 32 , 33. I almindelighed, konstruktion og validering af testmetoder primært bruges af forskere giver en meget god vurdering af ACs modificeret med virus-afledte peptider stadiet indledende udvikling effektivt at komme ind og levere den nyttelast inde målcellerne og target tumorer.

TAT og NLS-modificerede ACs har belyst nøgleområder til yderligere forbedring af nyttelasten levering inden kræftceller og tumorer. Med hensyn til NLS-modificerede ACs, kan effektivitet i intracellulære ophobning være beskedne 23,31,34. Ineffektiv intracellulære ophobning er forårsaget af fortsatte endosomal entrapment. In vivo tumor målretning kan også blive formindsket med begge Tat og NLS-modificerede ACs. De aktive sekvenser af Tat og NLS indeholder flere positive ladede rester. Når knyttet til mAbs, kan den samlede kationiske afgift være betydeligt øgede 35. Som en konsekvens har af Tat og NLS-modificerede ACs øget optagelse i sundt væv og øget hurtige blod clearance.

Vores gruppe udviklet et komposit stof bestående af cholic syre knyttet til NLS (ChAcNLS; Figur 1). ChAcNLS-ændret ACs er stand til at øge intracellulære ophobning af leverede radioisotoper og forbedre tumor målretning i forhold til NLS-modificerede og traditionelle ACs 33,34. Mekanismen bag cholic syre er inspireret af udvalgte nonenveloped virus, der ikke kan stole på membran fusion at udnytte cholic syre til at udløse endosome flugt gennem dannelsen af ceramid evne. For eksempel, rekrutter svin enteriske virus cholic syre, der aktiverer sphingomyelinase, som katalyserer hydrolyse af sphingomyelin i ceramid 36,37,38. Dette destabiliserer endosomal membran og giver mulighed for virus undslippe. Således er cholic syre en anden virus-afledte komponent, der supplerer NLS.

Da feltet bevæger sig fremad og fremtidige forekommer fremskridt i nyttelast levering af ACs modificeret med virus-afledte peptider, det er et belejligt tidspunkt at give visuelle demonstrationer af deres biokemiske og funktionelle egenskaber under indledende udvikling. Her beskriver vi vores protokol for den oprindelige vurdering af virus-afledte peptid-modificerede ACs for effektive og enkle bestemmelse af intracellulære ophobning og tumor målretning i den tidlige fase udvikling. Vi bruger det kommercielt tilgængelige mAbs 7 g 3 og A14 som eksempel modelsystemer. Procedure 1 beskriver brugen af SDS-PAGE som en metode, der giver mulighed for ‘ go/no go’ beslutninger for beregnede ACs. Procedure 2 beskriver en metode ved hjælp af trypsinization giver mulighed for bedre visualisering af AC intracellulære distribution og akkumulering. Procedure 3 beskriver en metode til forbedret intracellulære fraktionering til præcist bestemme nukleare lokalisering. I denne procedure vi udnytte nyttelast 64Cu (t1/2 = 12,7 h) fordi det er sårbare over for cellulære efflux og en positron emitter 10. Således er beskriver proceduren 4 i vivo tumor målretning karakterisering af PET imaging for at visualisere tumor optagelse i forhold til baggrund (dvs. nontarget sunde væv) og afgøre, om eksemplet med AC kan konkret og effektivt Target tumorer. Disse metoder er tilstrækkelig for efterforskerne udvikle ACs modificeret med virus-afledte peptider til at identificere kandidater til videre avancement.

Protocol

De i vivo dyreforsøg beskrevet blev udført efter en godkendt protokol og under de etiske retningslinjer for Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke etiske komité for animalsk eksperimenter. 1. antistof peptid konjugation Bemærk: ChAcNLS kan syntetiseres ved enhver kommerciel peptid producent eller Universitet-tilknyttede peptid syntese serviceplatform. Syntesen af ChAcNLS kan findes i reference 34. For procedurer 1 og 2 brug…

Representative Results

For Procedure 1, opførelsen af 7 g 3 modificeret med ChAcNLS brug af sulfo-Investeringsfondene, som en crosslinker er meget pålidelig. Typisk, når læsset på en 12% gel og analyseret af SDS-PAGE, dette resulterer i en identificerbar trinvis stigning i MW proportionalt med stigende sulfo-Investeringsfondene-til – 7 g 3 nøgletal bruges og giver mulighed for de tunge og lette kæder vurderes individuelt for ChAcNLS konjugering (figur 3). 7G 3 reagerede på 10-, 20-, 25-…

Discussion

Større mål af systemisk levering af anticancer-midler er at øge ophobning på tumor site, og optagelse i kræftceller og formindske uønskede bivirkninger i sundt væv. AC målrettet levering af molekylære nyttelast at tumorceller er en meget lovende metode til at behandle og afsløre tumorer. Men manglen effekt skyldes endosome fastklemning og ned stream lysosomale nedbrydning forbliver en vigtig udfordring. Mens denne protokol udnytter ChAcNLS peptid som et eksempel for opførelsen af næste generation ACs, kan de …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev finansieret af Cancer Research Society (Canada) og CIMS. Forfatterne takke Dr. Samia Ait-Mohand og Jean-Francois Beaudoin for bistand. Dr. Angel Lopez (Universitet i South Australia) for mAb A14.

Materials

Sulfo-SMCC Thermo Scientific 22122 There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters EMD Millipore UFC505096 There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards BioRad 1610375EDU Mulicolor recombinant proteins from 10-250 kDa.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200056 100 or 500 mL volumes to choose from.
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate Thermo Scientific A-21235 1-10 μg/mL recommended
NOTA-NHS CheMatech C100
Lamin A/C antibody (N-18) Santa Cruz Biotechnology sc-6215
Rab7 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376362
A14 mAb BD Biosciences 555902
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Thermo Scientific NP0007
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-25ML
TF-1a cells ATCC ATCC CRL-2003
RPMI 1640 medium ATCC ATCC 30-2001
RIPA lysis and extraction buffer Thermo Scientific 89900
AMIDE medical imaging software available at amide.sourceforge.net Completely free download
FluoView FV1000 Confocal Microscope Olympus
Fluoview Software Olympus www.olympus-lifescience.com
ITLC strips Biodex 150-771
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verma, S., et al. Trastuzumab emtansine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 367 (19), 1783-1791 (2012).
  2. Younes, A., et al. Results of a pivotal phase II study of brentuximab vedotin for patients with relapsed or refractory Hodgkin’s lymphoma. Journal of Clinical Oncology. 30 (18), 2183-2189 (2012).
  3. Bouchelouche, K., Choyke, P. L., Capala, J. Prostate specific membrane antigen- a target for imaging and therapy with radionuclides. Discovery Medicine. 9 (44), 55-61 (2010).
  4. Hamilton, G. S. Antibody-drug conjugates for cancer therapy: The technological and regulatory challenges of developing drug-biologic hybrids. Biologicals. 43 (5), 318-332 (2015).
  5. Deonarain, M. P., Yahioglu, G., Stamati, I., Marklew, J. Emerging formats for next-generation antibody drug conjugates. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (5), 463-481 (2015).
  6. Barok, M., Joensuu, H., Isola, J. Trastuzumab emtansine: mechanisms of action and drug resistance. Breast Cancer Research. 16 (2), (2014).
  7. Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23 (9), 1137-1146 (2005).
  8. Alley, S. C., Okeley, N. M., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (4), 529-537 (2010).
  9. Austin, C. D., et al. Endocytosis and sorting of ErbB2 and the site of action of cancer therapeutics trastuzumab and geldanamycin. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5268-5282 (2004).
  10. Bryan, J. N., et al. Comparative uptakes and biodistributions of internalizing vs. noninternalizing copper-64 radioimmunoconjugates in cell and animal models of colon cancer. Nuclear Medicine and Biology. 32 (8), 851-858 (2005).
  11. Chen, R., et al. CD30 Downregulation, MMAE Resistance, and MDR1 Upregulation Are All Associated with Resistance to Brentuximab Vedotin. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1376-1384 (2015).
  12. Fuchs, H., Weng, A., Gilabert-Oriol, R. Augmenting the Efficacy of Immunotoxins and Other Targeted Protein Toxins by Endosomal Escape Enhancers. Toxins (Basel). 8 (7), (2016).
  13. Olsnes, S., Sandvig, K., Petersen, O. W., van Deurs, B. Immunotoxins–entry into cells and mechanisms of action. Immunology Today. 10 (9), 291-295 (1989).
  14. Zheng, D., et al. Virus-derived anti-inflammatory proteins: potential therapeutics for cancer. Trends in Molecular Medicine. 18 (6), 304-310 (2012).
  15. Kristensen, M., Birch, D., Morck Nielsen, ., H, Applications and Challenges for Use of Cell-Penetrating Peptides as Delivery Vectors for Peptide and Protein Cargos. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), (2016).
  16. Yezid, H., Konate, K., Debaisieux, S., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Mechanism for HIV-1 Tat insertion into the endosome membrane. Journal of Biological Chemistry. 284 (34), 22736-22746 (2009).
  17. Escriou, V., Carriere, M., Scherman, D., Wils, P. NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (2), 295-306 (2003).
  18. Pouton, C. W., Wagstaff, K. M., Roth, D. M., Moseley, G. W., Jans, D. A. Targeted delivery to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (8), 698-717 (2007).
  19. Anderson, D. C., et al. Tumor cell retention of antibody Fab fragments is enhanced by an attached HIV TAT protein-derived peptide. Biochemical Biophysical Research Communications. 194 (2), 876-884 (1993).
  20. Chen, P., et al. Nuclear localizing sequences promote nuclear translocation and enhance the radiotoxicity of the anti-CD33 monoclonal antibody HuM195 labeled with 111In in human myeloid leukemia cells. Journal of Nuclear Medicine. 47 (5), 827-836 (2006).
  21. Cornelissen, B., Hu, M., McLarty, K., Costantini, D., Reilly, R. M. Cellular penetration and nuclear importation properties of 111In-labeled and 123I-labeled HIV-1 tat peptide immunoconjugates in BT-474 human breast cancer cells. Nuclear Medicine and Biology. 34 (1), 37-46 (2007).
  22. Costantini, D. L., Chan, C., Cai, Z., Vallis, K. A., Reilly, R. M. (111)In-labeled trastuzumab (Herceptin) modified with nuclear localization sequences (NLS): an Auger electron-emitting radiotherapeutic agent for HER2/neu-amplified breast cancer. Journal of Nuclear Medicine. 48 (8), 1357-1368 (2007).
  23. Fasih, A., et al. (1)(1)(1)In-Bn-DTPA-nimotuzumab with/without modification with nuclear translocation sequence (NLS) peptides: an Auger electron-emitting radioimmunotherapeutic agent for EGFR-positive and trastuzumab (Herceptin)-resistant breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 135 (1), 189-200 (2012).
  24. Hu, M., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).
  25. Kameyama, S., et al. Effects of cell-permeating peptide binding on the distribution of 125I-labeled Fab fragment in rats. Bioconjugate Chemistry. 17 (3), 597-602 (2006).
  26. Kersemans, V., Cornelissen, B., Minden, M. D., Brandwein, J., Reilly, R. M. Drug-resistant AML cells and primary AML specimens are killed by 111In-anti-CD33 monoclonal antibodies modified with nuclear localizing peptide sequences. Journal of Nuclear Medicine. 49 (9), 1546-1554 (2008).
  27. Mie, M., et al. Intracellular delivery of antibodies using TAT fusion protein. Biochemical Biophysical Research Communications. 310 (3), 730-734 (2003).
  28. Niesner, U., et al. Quantitation of the tumor-targeting properties of antibody fragments conjugated to cell-permeating HIV-1 TAT peptides. Bioconjugate Chemistry. 13 (4), 729-736 (2002).
  29. Stein, S., et al. A disulfide conjugate between anti-tetanus antibodies and HIV (37-72)Tat neutralizes tetanus toxin inside chromaffin cells. FEBS Letters. 458 (3), 383-386 (1999).
  30. Tolstikov, V. V., Cole, R., Fang, H., Pincus, S. H. Influence of endosome-destabilizing peptides on efficacy of anti-HIV immunotoxins. Bioconjugate Chemistry. 8 (1), 38-43 (1997).
  31. Gao, C., Leyton, J. V., Schimmer, A. D., Minden, M., Reilly, R. M. Auger electron-emitting 111In-DTPA-NLS-CSL360 radioimmunoconjugates are cytotoxic to human acute myeloid leukemia (AML) cells displaying the CD123/CD131 phenotype of leukemia stem cells. Applied Radiation and Isotopes. 110, 1-7 (2015).
  32. Leyton, J. V., et al. Auger electron radioimmunotherapeutic agent specific for the CD123+/CD131- phenotype of the leukemia stem cell population. Journal of Nuclear Medicine. 52 (9), 1465-1473 (2011).
  33. Paquette, M., et al. NLS-cholic acid conjugation to IL-5Rα-specific antibody improves cellular accumulation and in vivo tumor-targeting properties in a bladder cancer model. Bioconjugate Chemistry. , (2018).
  34. Beaudoin, S., et al. ChAcNLS, a Novel Modification to Antibody-Conjugates Permitting Target Cell-Specific Endosomal Escape, Localization to the Nucleus, and Enhanced Total Intracellular Accumulation. Molecular Pharmaceutics. 13 (6), 1915-1926 (2016).
  35. Boswell, C. A., et al. Effects of charge on antibody tissue distribution and pharmacokinetics. Bioconjugate Chemistry. 21 (12), 2153-2163 (2010).
  36. Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. The crucial role of bile acids in the entry of porcine enteric calicivirus. Virology. 456-457, 268-278 (2014).
  37. Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. Ceramide formation mediated by acid sphingomyelinase facilitates endosomal escape of caliciviruses. Virology. 483, 218-228 (2015).
  38. Stancevic, B., Kolesnick, R. Ceramide-rich platforms in transmembrane signaling. FEBS Letters. 584 (9), 1728-1740 (2010).
  39. Testa, U., Pelosi, E., Frankel, A. CD 123 is a membrane biomarker and a therapeutic target in hematologic malignancies. Biomarker Research. 2 (1), 4 (2014).
  40. King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 155-166 (2000).
  41. Paquette, M., et al. Targeting IL-5Rα with antibody-conjugates reveals a strategy for imaging and therapy for invasive bladder cancer. Oncoimmunology. 6 (10), e1331195 (2017).
  42. Zeisler, S. Production of 64Cu on the Sherbrooke TR-PET cyclotron. Journal or Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 257 (1), (2004).
  43. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  44. Roy, M., et al. A dual tracer PET-MRI protocol for the quantitative measure of regional brain energy substrates uptake in the rat. Journal of Visualized Experiments. (82), e50761 (2013).
  45. Wakankar, A. A., et al. Physicochemical stability of the antibody-drug conjugate Trastuzumab-DM1: changes due to modification and conjugation processes. Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).
  46. Liu, J., Abid, S., Lee, M. S. Analysis of monoclonal antibody chimeric BR96-doxorubicin immunoconjugate by sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis with ultraviolet and laser-induced fluorescence detection. Analytical Biochemistry. 229 (2), 221-228 (1995).
  47. Rege, K., Patel, S. J., Megeed, Z., Yarmush, M. L. Amphipathic peptide-based fusion peptides and immunoconjugates for the targeted ablation of prostate cancer cells. Cancer Research. 67 (13), 6368-6375 (2007).
  48. Zhan, J., Ge, L., Shen, J., Wang, K., Zheng, S. A trans-Golgi network retention signal YQRL fused to ricin A chain significantly enhances its cytotoxicity. Biochemical Biophysical Research Communications. 313 (4), 1053-1057 (2004).
  49. Zhan, J., Stayton, P., Press, O. W. Modification of ricin A chain, by addition of endoplasmic reticulum (KDEL) or Golgi (YQRL) retention sequences, enhances its cytotoxicity and translocation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 46 (1), 55-60 (1998).
  50. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The bioconjugation and radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled antibodies. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).

Tags

Antibody-conjugatesViral-derived PeptidesCellular AccumulationTumor TargetingPET ImagingNuclear LocalizationTF1A CellsColic-acidMonoclonal AntibodiesTrypsinEDTARPMI1640PFASucroseTriton X-100Alexa Fluor 647
check_url/55440?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Beaudoin, S., Paquette, M., Fafard-Couture, L., Tremblay, M. A., Lecomte, R., Guérin, B., Leyton, J. V. Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting. J. Vis. Exp. (133), e55440, doi:10.3791/55440 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image