सेलुलर संचय बढ़ाने और ट्यूमर लक्ष्यीकरण में सुधार के लिए वायरल-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स के साथ संशोधित एंटीबॉडी-conjugates का प्रारंभिक मूल्यांकन
Summary
वायरल-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स एंटीबॉडी करने के लिए युग्मित-conjugates (ACs) एक वृद्धि ट्यूमर कोशिका संचय के साथ आणविक पेलोड देने की क्षमता के कारण गति प्राप्त दृष्टिकोण है. पेप्टाइड विकार, एसी और पेलोड intracellular संचय का मूल्यांकन करने के लिए आम तरीकों का उपयोग, और ट्यूमर लक्ष्यीकरण, इस प्रोटोकॉल प्रमुख प्रारंभिक विकास चरणों के दौरान शोधकर्ताओं में मदद करता है.
Abstract
एंटीबॉडी-conjugates (ACs) वायरस व्युत्पन्न पेप्टाइड्स के साथ संशोधित एक संभावित शक्तिशाली वर्ग आणविक पेलोड के लिए कैंसर के उपचार और इमेजिंग में इस्तेमाल किया सेलुलर संचय की वजह से वर्तमान ACs पर उपयोग कर रहे हैं. जल्दी एसी के दौरान इन विट्रो विकास, प्रतिदीप्ति तकनीक और radioimmunoassays intracellular स्थानीयकरण, संचय दक्षता, और लक्ष्य कोशिका विशिष्टता का निर्धारण करने के लिए पर्याप्त हैं । वर्तमान में, एसी intracellular संचय और स्थानीयकरण के मूल्यांकन के लिए कक्षों की तैयारी के लिए मानकीकृत तरीकों पर कोई आम सहमति नहीं है । वायरस व्युत्पंन पेप्टाइड्स के साथ संशोधित ACs के प्रारंभिक परीक्षण महत्वपूर्ण है, खासकर यदि कई उंमीदवारों का निर्माण किया गया है । प्रतिदीप्ति द्वारा intracellular संचय का निर्धारण सेल सतह पर ACs से पृष्ठभूमि संकेत से प्रभावित किया जा सकता है और संचय की व्याख्या जटिल । radioimmunoassays के लिए, आम तौर पर इलाज कोशिकाओं fractionated और रेडियोधर्मिता मापा अलग सेल डिब्बों में हैं. हालांकि, कक्ष lysis कक्ष से कक्ष तक बदलता है और अक्सर परमाणु और cytoplasmic डिब्बों को पर्याप्त रूप से पृथक नहीं कर रहे हैं । यह पेलोड वितरण संपत्तियों पर भ्रामक डेटा का उत्पादन कर सकते हैं । radiolabeled वायरस के नसों में इंजेक्शन व्युत्पंन पेप्टाइड-संशोधित ACs ट्यूमर असर चूहों में रेडियोन्यूक्लाइड इमेजिंग द्वारा पीछा करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है ट्यूमर लक्ष्यीकरण और पेलोड वितरण संपत्तियों के vivo में चरण का निर्धारण करने के लिए विकास. हालांकि, यह एक अपेक्षाकृत हाल ही में उंनति और कुछ समूहों वायरस-व्युत्पन्न पेप्टाइड संशोधित इस तरीके से ACs है मूल्यांकन किया है । हम इलाज कोशिकाओं के प्रसंस्करण का वर्णन करने के लिए और अधिक सही वायरस-व्युत्पंन पेप्टाइड संशोधित एसी संचय जब फोकल माइक्रोस्कोपी और radioimmunoassays का उपयोग कर मूल्यांकन । विशेष रूप से, trypsinizing कक्षों के लिए एक विधि कक्ष सरफ़ेस बाउंड ACs को निकालने के लिए । हम भी सेलुलर अंश में सुधार के लिए एक तरीका प्रदान करते हैं । अंत में, इस प्रोटोकॉल एक vivo में ट्यूमर-असर चूहों में प्रारंभिक ट्यूमर लक्ष्यीकरण संपत्तियों के मूल्यांकन के लिए पोजीट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) का उपयोग कर विधि प्रदान करता है । हम इस प्रोटोकॉल में एक उदाहरण पेलोड के रूप में रेडियो आइसोटोप 64 घन (टी 1/2 = 12.7 एच) का उपयोग करें ।
Introduction
एंटीबॉडी-conjugates (ACs) है कि कैंसर के उपचार में सुधार के लिए और ट्यूमर का पता लगाने के लिए प्रभावी दवाओं के एक परिवर्तनकारी वर्ग में परिपक्व हो रहे हैं । radioisotopes, छोटे अणुओं, और जैविक विषाक्त पदार्थों के रूप में आणविक पेलोड के लिए एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (मॉब) संयुग्मित से बना है, ACs अति सुंदर लक्ष्य प्रतिजन संबध और विशिष्टता के साथ कैंसर कोशिकाओं को इन पेलोड देने में सक्षम हैं । इस प्रकार ACs काफी विशिष्ट विषाक्तता को कम करने और ट्यूमर साइट पर पेलोड गतिविधि को बढ़ाने की क्षमता है. चिकित्सकीय, ACs साइटोटोक्सिक छोटे अणुओं के परिवहन (सामांयतः एंटीबॉडी दवा conjugates के रूप में निर्दिष्ट) स्तन कैंसर और Hodgkin लिंफोमा जो पारंपरिक उपचार में विफल रहे है के साथ रोगियों के इलाज के लिए अनुमोदित किया गया है 1, 2. इसके अलावा, ACs ट्रांसपोर्टिंग radioisotopes (सामान्यतः radioimmunoconjugates के रूप में जाना जाता है) भी विकास में हैं. एक एसी इमेजिंग के लिए एक रेडियो आइसोटोप परिवहन प्रोस्टेट कैंसर की पहचान के लिए मंजूरी दे दी है मेटास्टेसिस 3 । के साथ कई और अधिक चिकित्सीय 4अनुमोदन के लिए प्रस्तुत acs, आशावाद के भविष्य के लिए उच्च है के लिए कैंसर की देखभाल 5में सुधार acs ।
बहरहाल, जब chemotherapeutics या radioisotopes देने, ACs कठिनाई प्रभावी ढंग से लक्ष्य कोशिकाओं के अंदर इन पेलोड जमते । यह पहलू काफी लंबे समय तक चलने रोग मुक्त अस्तित्व या उच्च कंट्रास्ट ट्यूमर इमेजिंग 6,7प्रदान करने के लिए ACs की अक्षमता में कई मामलों में योगदान देता है । सामांय में, एक बार ACs उनके लक्ष्य प्रतिजन वे एक रिसेप्टर के रूप में जाना जाता प्रक्रिया के माध्यम से आंतरिक रहे है बांध-मध्यस्थता endocytosis । ACs तो endosomes अंदर फंस और क्षरण और पेलोड रिलीज के लिए lysosomes के लिए अवैध रूप से कर रहे है 8। intracellular के लिए एक उच्च पेलोड विशिष्टता और लक्ष्य कैंसर की कोशिकाओं के खिलाफ प्रभावकारिता को प्राप्त करने के ACs के लिए तस्करी प्रक्रिया चुनौतियां बन गई । उदाहरण के लिए, Her2 (चिकित्सकीय AC Trastuzumab-emtansine के लिए लक्ष्य) जैसे कई एंटीजन पहले 30 मिनट 9में बाउंड एंटीबॉडी के 85% तक रीसायकल कर सकते हैं । इसके अलावा, एक बार गिरावट होती है, जारी chemotherapeutics और radioisotopes सक्रिय रूप से वृद्धि की अभिव्यक्ति और/या झिल्ली जुड़े परिवहन प्रोटीन 10,11की गतिविधि से निर्यात किया जा सकता है । Lysosome क्षरण भी ऐसे चिकित्सीय एंजाइमों और oligonucleotides है कि 12,13निष्क्रिय किया जा सकता है के रूप में उपंयास जैविक पेलोड के वितरण में बाधा उत्पंन करता है । संक्षेप में, कैंसर कोशिका abrogating पर अत्यंत प्रभावी पेलोड के ACs द्वारा वितरित की आवश्यक intracellular संचय है ।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे ACs की अवधारणा को लागू करने के लिए-वायरस व्युत्पंन पेप्टाइड्स, विशेष रूप से endosome फंसाने और कोशिका नाभिक को स्थानीयकरण भागने के लिए युग्मित । इस तरह के परिष्कार के साथ मेजबान सेल प्रणालियों में हेरफेर करने के लिए, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि वायरस व्युत्पंन प्रोटीन और पेप्टाइड्स के रूप में संभावित दवाओं के विकास लंबे समय से चिकित्सीय अनुसंधान 14में बैठ गया है । लाखों वर्षों के लिए वायरस को प्रभावी ढंग से मेजबान कोशिकाओं में प्रवेश करने के लिए सामान्य शारीरिक स्तनधारी कोशिका प्रणालियों का दोहन करने में सक्षम प्रोटीन का एक असाधारण संग्रह प्राप्त करने के लिए विकसित किया है. वायरस है कि रिसेप्टर की मध्यस्थता endocytosis के माध्यम से आंतरिक रहे हैं के लिए, वे भी lysosome के लिए तस्करी भागने के साथ चुनौती दी है, जहां की एक स्थानीयकृत एकाग्रता के हमले के लिए जीवन रक्षा के लिए समस्याग्रस्त किया जा सकता है । एक अच्छी तरह से वायरल व्युत्पंन endosome फंसाने भागने के लिए दवा वितरण में उपयोग पेप्टाइड के मानव इम्यूनो वायरस प्रतिलेखन की transactivator (जैसे) प्रोटीन 15है । जैसे कम पीएच जिस पर बिंदु प्रोटीन के गठन के परिवर्तन को संवेदन द्वारा फंसाने endosome भागने में सक्षम है जैसे ही में डालने के लिए और endosomal झिल्ली 16बाधित । यह जैसे में परिणाम-पेलोड कोशिका द्रव्य का उपयोग करने में सक्षम conjugates । दूसरी वायरल इस प्रोटोकॉल से संबंधित हेरफेर तत्व को चिकित्सकीय जीन और नाभिक को दवाओं के 17देने के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण है । वायरस को सफलतापूर्वक नाभिकीय ताकना परिसर (एनपीसी) के माध्यम से गुजर द्वारा परमाणु झिल्ली पिछले प्रगति के लिए मेजबान सेल मशीनरी में हेरफेर करने के लिए विकसित किया है । सेलुलर अणुओं होते है (या प्रोटीन है कि शामिल करने के लिए बाध्य) परमाणु स्थानीयकरण संकेत (NLSs) परमाणु परिवहन प्रोटीन के लिए बाध्यकारी (जैसे karyopherins α और β) है, जो एनपीसी के माध्यम से आवश्यक आंदोलनों प्रदान करने के लिए आवश्यक । वायरस एनएलएस अनुक्रम है कि उंहें गढ़शंकर में नाभिक के लिए मेजबान सेल परिवहन प्रोटीन का उपयोग करने की क्षमता के साथ उपलब्ध कराने के शामिल करने के लिए प्रोटीन विकसित किया है 18।
कई ACs पहले जैसे-और एनएलएस-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स के साथ कार्यात्मक किया गया है और कैंसर कोशिकाओं के अंदर जमा करने के लिए और ट्यूमर को लक्षित करने की क्षमता के लिए जांच की है 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (Table 1). अध्ययन साइटोटोक्सिक पेलोड पहुंचाने का प्रदर्शन किया है कि वायरस के साथ संशोधित ACs-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स काफी सेलुलर संचय, cytotoxicity वृद्धि करने में सक्षम हैं, और unभएकै ACs 22,26पर ट्यूमर की हत्या. एसी के इस उपन्यास क्लास के लिए एक कॉमन फीचर उनका कंस्ट्रक्शन है । आमतौर पर, पेप्टाइड्स एक टर्मिनल cysteine एक मुक्त sulfhydryl समूह प्रदान कर रहे हैं । MAbs पहले एक गैर-hydroxysuccinimide ( एनएच एस) और विपरीत छोर पर maleimide समूहों से युक्त bifunctional crosslinker के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त कर रहे हैं । एन एच एस एस्टर मॉब पर प्राथमिक अमीन के साथ प्रतिक्रिया के लिए बांड के बीच फार्म का । मुक्त maleimide समूहों के साथ प्रतिक्रिया मॉब तो एक thioester बांड फार्म और इस तरह पेप्टाइड और मॉब को जोड़ने के लिए पेप्टाइड्स पर sulfhydryl समूहों के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की है । हालांकि homobifunctional crosslinkers 28इस्तेमाल किया गया है, heterobifunctional crosslinker अधिक सामांयतः वायरस व्युत्पंन पेप्टाइड के निर्माण में प्रयोग किया जाता है-ACs 22,23,26, 31,32. यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से उपयोग में आसानी के लिए crosslinker sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) का उपयोग करता है और क्योंकि यह अनुमोदित एंटीबॉडी-औषध संयुग्मी Trastuzumab-emtansine में उपयोग किया जाता है और कई वायरस-व्युत्पन्न पेप्टाइड-ACs 8,22,23,26,31,32. सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-PAGE) प्रारंभिक रूप से विकार दक्षता का निर्धारण करने के लिए और अर्द्ध मॉब प्रति पेप्टाइड्स की संख्या को बढ़ाता है के लिए प्राथमिक विधि है । फोकल माइक्रोस्कोपी एक फ्लोरोसेंट-लेबल द्वितीयक एंटीबॉडी मॉब के लिए विशिष्ट का उपयोग करते हुए आमतौर पर शुरू में वायरस-व्युत्पन्न पेप्टाइड-संशोधित ACs के intracellular वितरण गुणों का मूल्यांकन करने के लिए विधि है । इस प्रकार अब तक, radioisotopes प्राथमिक पेलोड वायरस व्युत्पन्न पेप्टाइड संशोधित ACs द्वारा वितरित कर रहे हैं । Radioisotopes लाभप्रद हैं क्योंकि कोशिकाओं में रेडियोधर्मिता आसानी से गामा गिनती से quantified है. इसके अलावा, ACs है कि मानव कैंसर के माउस मॉडल में अनुवाद कर रहे है ट्यूमर का मूल्यांकन करने की क्षमता के साथ शोधकर्ताओं प्रदान एक फोटॉन उत्सर्जन गणना टोमोग्राफी और पोजीट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) के रूप में आणविक इमेजिंग विधियों का उपयोग कर लक्ष्यीकरण 23 , 32 , 33. सामांय में, निर्माण और सत्यापन परीक्षण के तरीकों मुख्य रूप से शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया वायरस के साथ संशोधित ACs के एक बहुत अच्छा आकलन प्रदान-प्रारंभिक विकास के चरण के दौरान पेप्टाइड्स व्युत्पंन को प्रभावी ढंग से दर्ज करें और उद्धार लक्ष्य कोशिकाओं के अंदर पेलोड और ट्यूमर को लक्षित करने के लिए ।
जैसे-और एनएलएस-संशोधित ACs आगे पेलोड प्रसव के कैंसर की कोशिकाओं के अंदर और ट्यूमर के लिए सुधार के लिए महत्वपूर्ण क्षेत्रों को प्रकाशित किया है । एनएलएस के संबंध में संशोधित ACs, intracellular संचय में दक्षता 23,31,34मामूली हो सकता है । अकुशल intracellular संचय जारी endosomal फंसाने के कारण होता है. vivo में ट्यूमर लक्ष्यीकरण भी दोनों जैसे के साथ कम किया जा सकता है-और एनएलएस-संशोधित ACs । जैसे और एनएलएस के सक्रिय दृश्यों कई सकारात्मक आरोप लगाया अवशेष होते हैं । जब mAbs से जुड़ी है तो कुल मिलाकर cationic चार्ज में काफी वृद्धि की जा सकती है 35. एक परिणाम के रूप में, जैसे-और एनएलएस-संशोधित ACs स्वस्थ ऊतकों में तेज वृद्धि हुई है और तेजी से रक्त निकासी में वृद्धि हुई है ।
हमारे समूह ने एनएलएस से जुड़े cholic अम्ल से मिलकर एक समग्र यौगिक विकसित किया (ChAcNLS; चित्र 1) । ChAcNLS-संशोधित ACs दिया radioisotopes के intracellular संचय बढ़ाने के लिए और एनएलएस-संशोधित और पारंपरिक ACs 33,34की तुलना में ट्यूमर लक्ष्यीकरण में सुधार कर रहे हैं. cholic एसिड के पीछे तंत्र cholic एसिड का उपयोग करने के लिए ceramide के गठन के माध्यम से endosome भागने को ट्रिगर करने के लिए झिल्ली फ्यूजन पर निर्भर नहीं कर सकते कि चुनिंदा वायरस का चयन की क्षमता से प्रेरित है । उदाहरण के लिए, सुअर का एंट्रेंस वायरस रंगरूटों cholic एसिड कि sphingomyelinase को सक्रिय करता है, जो hydrolysis की sphingomyelin में catalyzes के लिए 36, 37, 38. यह endosomal झिल्ली स्थिर और वायरस से बचने के लिए अनुमति देता है । इस प्रकार, cholic एसिड एक और वायरस व्युत्पंन घटक है कि एनएलएस पूरक है ।
के रूप में इस क्षेत्र में आगे बढ़ता है और भविष्य की प्रगति पेलोड वितरण में वायरस व्युत्पन्न पेप्टाइड्स के साथ संशोधित ACs द्वारा होते हैं, यह प्रारंभिक विकास के दौरान उनके जैव रासायनिक और कार्यात्मक विशेषताओं के दृश्य प्रदर्शनों प्रदान करने के लिए एक उपयुक्त समय है । यहां, हम वायरस के प्रारंभिक मूल्यांकन के लिए हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन-व्युत्पन्न पेप्टाइड संशोधित प्रारंभिक चरण के विकास के दौरान intracellular संचय और ट्यूमर लक्ष्यीकरण के कुशल अभी तक सरल निर्धारण के लिए ACs । हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध mAbs 7G3 और A14 का उपयोग उदाहरण मॉडल सिस्टंस के रूप में करते हैं । प्रक्रिया 1 का उपयोग करता है एक विधि के रूप में एसडीएस पृष्ठ का वर्णन है कि ‘ के लिए जाओ/ प्रक्रिया 2 एक trypsinization एसी intracellular वितरण और संचय के बेहतर दृश्य के लिए अनुमति का उपयोग कर विधि का वर्णन करता है । प्रक्रिया 3 सही ढंग से परमाणु स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए बेहतर intracellular भिन्नीकरण के लिए एक विधि का वर्णन. इस प्रक्रिया में हम पेलोड 64घन (टी1/2 = 12.7 एच) का उपयोग क्योंकि यह सेलुलर समाप्ति के लिए कमजोर है और एक पोजीट्रान उत्सर्जक 10है । इस प्रकार, प्रक्रिया 4 vivo में ट्यूमर लक्ष्यीकरण लक्षण वर्णन पीईटी इमेजिंग द्वारा पृष्ठभूमि (यानी निशाना स्वस्थ ऊतकों) के सापेक्ष ट्यूमर को कल्पना करने के लिए और निर्धारित करते हैं कि क्या उदाहरण एसी विशेष रूप से और प्रभावी ढंग से कर सकते हैं लक्ष्य ट्यूमर । इन तरीकों को आगे की उंनति के लिए उंमीदवारों की पहचान करने के लिए वायरस व्युत्पंन पेप्टाइड्स के साथ संशोधित ACs विकास जांचकर्ताओं के लिए पर्याप्त हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
विरोधी कैंसर एजेंटों की प्रणालीगत प्रसव के प्रमुख लक्ष्यों को ट्यूमर साइट पर संचय बढ़ाने के लिए कर रहे हैं, और कैंसर की कोशिकाओं के भीतर, और स्वस्थ ऊतकों में अवांछित दुष्प्रभाव कम हो । ट्यूमर कोशिकाओं ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम कैंसर रिसर्च सोसायटी (कनाडा) और CIMS द्वारा वित्त पोषित किया गया । लेखकों ने डॉ॰ समिया Ait-मोहनी और जीन-फ्रेंकोइस Beaudoin को सहायता के लिए धन्यवाद दिया । एंजेल लोपेज (दक्षिण ऑस्ट्रेलिया के विश्वविद्यालय) मॉब A14 के लिए डॉ.
Materials
| Sulfo-SMCC | Thermo Scientific | 22122 | There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from. |
| Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters | EMD Millipore | UFC505096 | There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs. |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | BioRad | 1610375EDU | Mulicolor recombinant proteins from 10-250 kDa. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200056 | 100 or 500 mL volumes to choose from. |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Scientific | A-21235 | 1-10 μg/mL recommended |
| NOTA-NHS | CheMatech | C100 | |
| Lamin A/C antibody (N-18) | Santa Cruz Biotechnology | sc-6215 | |
| Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-376362 | |
| A14 mAb | BD Biosciences | 555902 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0007 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-25ML | |
| TF-1a cells | ATCC | ATCC CRL-2003 | |
| RPMI 1640 medium | ATCC | ATCC 30-2001 | |
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
| AMIDE medical imaging software | available at amide.sourceforge.net | Completely free download | |
| FluoView FV1000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Fluoview Software | Olympus | www.olympus-lifescience.com | |
| ITLC strips | Biodex | 150-771 |
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