Innledende vurdering av antistoff-conjugates endret med Viral-avledet peptider for øke mobilnettet akkumulering og forbedre svulst målretting

Summary

Viral-avledet peptider koblet til antistoff-conjugates (ACs) er en tilnærming frammarsj på grunn av potensialet å levere molekylær nyttelast med økt svulst celle akkumulering. Utnytte vanlige metoder for å evaluere peptid Bøyning, AC og nyttelast intracellulær akkumulering og svulst målretting, hjelper denne protokollen forskere fra viktige utviklingen faser.

Abstract

Antistoff-conjugates (ACs) endret med virus-avledet peptider er en potensielt mektig klasse av svulst celle levering agenter for molekylær nyttelast brukes i kreftbehandling og tenkelig på grunn av økt mobilnettet akkumulering over gjeldende ACs. Under tidlig AC i vitro er utvikling, fluorescens teknikker og radioimmunoassays tilstrekkelig for å bestemme intracellulær lokalisering, akkumulering effektivitet og målet cellen spesifisitet. Foreløpig er det ingen enighet om standardiserte metoder for å lage celler for å vurdere AC intracellulær akkumulering og lokalisering. Den innledende testingen av ACs endret med virus-avledet peptider er viktig spesielt hvis flere kandidater har blitt konstruert. Bestemme intracellulær akkumulering av fluorescens kan påvirkes av bakgrunnen signalet fra ACs på celleoverflaten og komplisere tolkningen av akkumulering. For radioimmunoassays, vanligvis behandlet celler er fraksjonert og radioaktiviteten i ulike celle rom målt. Men cellen lysis varierer fra celle til celle og ofte kjernefysiske og cytoplasmatiske rom er ikke godt nok isolert. Dette kan gi misvisende data på nyttelast levering egenskaper. Intravenøs injeksjon av radiolabeled virus-avledet peptid-endret ACs i svulst bærer mus etterfulgt av radionuklidenes bildebehandling er en kraftfull metode for å bestemme svulst målretting og nyttelast levering egenskaper på den i vivo fasen av utvikling. Men dette er en relativt ny framgang og få grupper har evaluert virus-avledet peptid-endret ACs på denne måten. Vi beskriver behandlingen av behandlet celler mer nøyaktig evaluere virus-avledet peptid-endret AC akkumulering ved AC confocal mikroskopi og radioimmunoassays. Spesielt bundet en metode for trypsinizing celler å fjerne celleoverflaten ACs. Vi tilbyr også en metode for å forbedre cellulære fraksjoneres. Til slutt gir denne protokollen en i vivo metode bruke fantes et positron utslipp tomografi (PET) for å vurdere første svulst målretting egenskaper i svulst rentebærende mus. Vi bruker den radioisotop ⁶⁴Cu (t_1/2 = 12,7 h) som et eksempel nyttelast i denne protokollen.

Introduction

Antistoff-conjugates (ACs) er biopharmaceuticals som er modning i en transformerende klasse av effektiv legemidler for utviklende kreft behandlinger og påvise svulster. Består av et monoklonalt antistoff (mAb) konjugert til molekylær nyttelast som radioisotopes, små molekyler og biologiske giftstoffer, ACs er i stand til å levere disse nyttelast til kreftceller med utsøkt målet antigen tilhørighet og spesifisitet. Dermed ACs har potensiale til betydelig redusere uspesifikke toksisitet og øke nyttelasten aktivitet på webområdet svulst. Terapeutisk, er ACs transport cytotoksiske små molekyler (ofte referert til som antistoff-stoff conjugates) godkjent for behandling av pasienter med brystkreft og Hodgkins lymfom som har mislyktes konvensjonelle behandlinger ^{1, 2}. I tillegg ACs transport radioisotopes (ofte referert til som radioimmunoconjugates) er også under utvikling. AC transport en radioisotope for bildebehandling er godkjent for å identifisere prostata kreft metastasering ³. Med mange mer terapeutiske ACs sendt for godkjenning ⁴, er optimisme høy for fremtiden for ACs å forbedre kreft omsorg ⁵.

Likevel, når leverer chemotherapeutics eller radioisotopes, ACs har problemer effektivt samler disse nyttelast i målcellene. Dette aspektet referert i mange tilfeller manglende evne av ACs å gi langvarig sykdom-fri overlevelse eller Høykontrast tumor imaging ^6,7. Generelt, når ACs binde deres mål antigenet er de internalisert gjennom en prosess kjent som reseptor-mediert endocytose. ACs deretter fanget inne endosomes og smugles i lysosomer til fornedrelse og nyttelast slipp ⁸. Intracellulær menneskehandel prosessen gir utfordringer for ACs å oppnå en høy nyttelast spesifisitet og effekt mot mål kreftceller. For eksempel mange antigener som Her2 (mål for terapeutisk AC Trastuzumab-emtansine) kan resirkulere opptil 85% av bundet antistoffer i første 30 min ⁹. Videre, når fornedrelse skjer, utgitt chemotherapeutics og radioisotopes kan aktivt eksporteres av økt uttrykk og/eller aktivitet av membran forbundet transport proteiner ^10,11. Lysosome fornedrelse også hindrer leveringen av romanen biologiske nyttelast som terapeutiske enzymer og oligonucleotides som kan være deaktivert ^12,13. Prinsipielt er kreftcelle svært effektiv på lertid nødvendig intracellulær akkumulering av payloads levert av ACs.

Denne protokollen beskriver hvordan du implementerer konseptet ACs-kombinert med virus-avledet peptider, spesielt for å unnslippe endosome entrapment og lokalisere til cellekjernen. Med slike raffinement å manipulere vertssystemer cellen, er det ikke overraskende at utviklingen av virus-avledet proteiner og peptider som potensielle biopharmaceuticals lenge er inngrodd i terapeutisk forskning ¹⁴. Angi vertsceller for millioner av år virus har utviklet seg til å erverve en eksepsjonell samling av proteiner utnytte normal fysiologiske pattedyr celle systemer for å effektivt. For virus som er internalisert via reseptor-mediert endocytose, er de også utfordret med rømmer handel til lysosome der angrep av en lokalisert konsentrasjon av proteaser kan være problematisk for overlevelse. Et godt preget viral-avledet peptid benyttet i narkotika-leveranser for å unnslippe endosome entrapment er humant immunsviktvirus transactivator transkripsjon (Tat) protein ¹⁵. TAT er stand til å unnslippe endosome entrapment ved sensing lav-pH da protein conformational endringer skje slik at Tat å sette seg inn i og forstyrre endosomal membran ¹⁶. Dette resulterer i Tat-nyttelast conjugates tilgang cytoplasma. Det andre viral manipulasjon elementet relatert til denne protokollen er fremgangsmåten som brukes til å levere terapeutiske gener og narkotika til kjernen ¹⁷. Virus har utviklet for å kunne manipulere verten celle maskiner for å komme videre forbi de kjernefysiske membranen av passerer gjennom kjernefysiske pore komplekse (NPC). Mobilnettet makromolekyler inneholder (eller binde proteiner som inneholder) kjernefysiske lokalisering signaler (NLSs) nødvendige for binding til kjernefysiske transportere proteiner (f.eks karyopherins α og β), som gir de nødvendige bevegelsene gjennom NPC. Virus har utviklet proteiner inneholder NLS sekvenser som gir dem muligheten til å utnytte verten celle transport proteiner for skytling i kjernen ¹⁸.

Mange ACs tidligere er functionalized med Tat – og NLS-avledet peptider og testet for deres evne til å samle inne kreftceller og målretting svulster ^{19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30} (tabell 1). Studier levere cytotoksiske nyttelast har vist at ACs endret med virus-avledet peptider er betydelig øke mobilnettet akkumulering, cytotoksisitet og svulst drepe over uforandret ACs ^22,26. Felles er for denne romanen klassen av AC deres konstruksjon. Peptider inneholder vanligvis en terminal cystein gir en gratis sulfhydryl gruppe. MAbs er første reagert med en noncleavable bifunctional crosslinker som inneholder N– hydroxysuccinimide (NHS) og maleimide grupper på motsatte ender. NHS estere reagerer med primære aminer på mAb å danne amid obligasjoner. Den reagert mAb med gratis maleimide grupper er deretter reagerte med sulfhydryl grupper på peptidene å danne en thioester bånd og dermed knytte peptid og mAb. Selv homobifunctional crosslinkers ha vært brukt ²⁸, heterobifunctional crosslinker er mer vanlig i byggingen av virus-avledet peptid-ACs ^{22,23,26, 31,32}. Denne protokollen bruker spesielt crosslinker sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) for sin brukervennlighet og fordi den brukes i godkjent antistoff-stoffet konjugat Trastuzumab-emtansine og mange virus-avledet peptid-ACs ^{8,22,23,26,31,32}. Natrium dodecyl sulfate polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side) er den primære metoden for først å bestemme Bøyning effektivitet og semi kvantifisere antall peptider per mAb. AC confocal mikroskopi bruker en fluorescently-merket sekundære antistoffer spesifikke for mAb er vanligvis metoden for å først vurdere intracellulær distribusjon egenskapene for virus-avledet peptid-endret ACs. Så langt, er radioisotopes de primære nyttelastene levert av virus-avledet peptid-endret ACs. Radioisotopes er en fordel fordi radioaktivitet i celler er lett kvantifisert ved gamma teller. I tillegg ACs som er oversatt til musen modeller av kreft hos mennesker gir forskere mulighet til å evaluere svulst målretting bruker molekylær tenkelig modaliteter som enkelt Foton utslipp beregnet tomografi og fantes et positron utslipp tomografi (PET) ^{23 , 32 , 33}., bygging og godkjenningen testing metoder primært brukes av forskere gir en meget god vurdering av ACs endret med virus-avledet peptider under den første utviklingsfasen effektivt angi og levere den nyttelast inne målet celler og målet svulster.

TAT – og NLS-endret ACs har opplyst nøkkelområder for ytterligere å forbedre nyttelast levering inne kreftceller og svulster. Med hensyn til NLS-endret ACs, kan effektiviteten intracellulær opphopning være beskjedne ^23,31,34. Ineffektiv intracellulær akkumulering skyldes fortsatte endosomal entrapment. I vivo svulst målretting kan også bli redusert med både Tat – og NLS-endret ACs. De aktive sekvensene av Tat og NLS inneholder flere positivt ladet rester. Knyttet til mAbs, kan den generelle kationisk være betydelig økt ³⁵. Som en konsekvens har av Tat – og NLS-endret ACs økt opptak i friske vevet og økt rask blod klaring.

Vår gruppe utviklet en sammensatt blanding bestående av cholic acid knyttet til NLS (ChAcNLS; Figur 1). ChAcNLS endret ACs kan øke intracellulær opphopning av leverte radioisotopes og forbedre svulst målretting sammenlignet NLS-modifisert og tradisjonelle ACs ^33,34. Mekanismen bak cholic syre er inspirert av evnen til å velge nonenveloped virus som ikke kan stole på membran fusion å utnytte cholic syre utløse endosome rømme gjennom dannelsen av ceramide. For eksempel rekrutter svin enteric virus cholic syre som aktiverer sphingomyelinase, som gir hydrolyse av sphingomyelin i ceramide ^36,37,38. Dette destabilizes endosomal membran og tillater virus flukt. Dermed er cholic syre en annen virus-avledet komponent som utfyller NLS.

Dette feltet beveger seg fremover og fremtidige forekommer fremskritt i nyttelast levering av ACs endret med virus-avledet peptider, det er en anledning til å gi visuelle demonstrasjoner av deres biokjemiske og funksjonelle egenskaper under utviklingen. Her beskriver vi våre protokollen for innledende vurdering av virus-avledet peptid-endret ACs for effektiv ennå enkel fastsettelse av intracellulær akkumulering og svulst målretting under tidlig utvikling. Vi bruke kommersielt tilgjengelige mAbs 7G 3 og A14 som eksempel modellsystemer. Fremgangsmåte 1 beskriver bruken av SDS side som en metode som gir ‘ go/no go’ beslutninger for konstruert ACs. Prosedyre 2 beskriver en metode med trypsinization gir forbedret visualisering av AC intracellulær distribusjon og akkumulering. Fremgangsmåten 3 beskriver en metode for forbedret intracellulær fraksjoneres å nøyaktig fastslå kjernefysiske lokalisering. I denne fremgangsmåten vi utnytter den nyttelast ⁶⁴Cu (t_1/2 = 12,7 h) fordi det er utsatt for mobilnettet middelklasseinnbyggere og er en fantes et positron emitter ¹⁰. Dermed beskriver prosedyren 4 i vivo svulst målretting karakterisering av PET imaging å visualisere svulst opptak i forhold til bakgrunnen (dvs. nontarget sunt vev) og finne ut om eksempelet AC kan spesielt og effektivt målet svulster. Disse metodene er tilstrekkelig for etterforskere utvikle ACs endret med virus-avledet peptider å identifisere kandidater for videre utvikling.

Protocol

I vivo dyreforsøkene beskrevet ble utført etter en godkjent protokoll og etiske retningslinjer sentrum Hospitalier Universitaire de Sherbrooke etikk for dyr eksperimenter. 1. antistoff peptid Bøyning Merk: ChAcNLS kan syntetiseres til enhver kommersiell peptid produsenten eller universitet-tilknyttede peptid synthesis tjenesten plattform. Syntese av ChAcNLS finnes i referanse 34. For prosedyrer 1 og 2 bruke mAb 7G 3, som er spesifik…

Representative Results

For prosedyren 1, bygging av 7G 3 endret med ChAcNLS med sulfo-SMCC som en crosslinker er svært pålitelig. Vanligvis når lastet opp på en 12% gel og analyseres av SDS side, dette resulterer i skjelnes gradvis økning i MW proporsjonal med økende sulfo-SMCC-til – 7G 3 prosenter brukes og tillater tunge og lette kjedene blir individuelt vurdert for ChAcNLS Bøyning (Figur 3). 7G 3 reagert på 10, 20, 25- og 50-til-1 sulfo-SMCC-til – 7G 3 prosenter etterfulgt av Rf mål…

Discussion

Store mål systemisk levering av anti-kreft agenter er å øke opphopning svulst området og opptak i kreftceller, og redusere uønskede bivirkninger i sunt vev. AC målrettet levering av molekylære payloads til kreftceller er en svært lovende tilnærming til å behandle og oppdage svulster. Men mangel på effekten forårsaket av endosome entrapment og ned strømmen lysosomale degradering er en viktig utfordring. Mens denne protokollen benytter ChAcNLS peptid som et eksempel for bygging av neste generasjon ACs, kan bes…

Materials

Sulfo-SMCC	Thermo Scientific	22122	There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters	EMD Millipore	UFC505096	There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards	BioRad	1610375EDU	Mulicolor recombinant proteins from 10-250 kDa.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Scientific	25200056	100 or 500 mL volumes to choose from.
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate	Thermo Scientific	A-21235	1-10 μg/mL recommended
NOTA-NHS	CheMatech	C100
Lamin A/C antibody (N-18)	Santa Cruz Biotechnology	sc-6215
Rab7 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-376362
A14 mAb	BD Biosciences	555902
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Scientific	NP0007
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148-25ML
TF-1a cells	ATCC	ATCC CRL-2003
RPMI 1640 medium	ATCC	ATCC 30-2001
RIPA lysis and extraction buffer	Thermo Scientific	89900
AMIDE medical imaging software	available at amide.sourceforge.net		Completely free download
FluoView FV1000 Confocal Microscope	Olympus
Fluoview Software	Olympus		www.olympus-lifescience.com
ITLC strips	Biodex	150-771