Kvantitativ visualisering af leukocytinfiltrat i en murin model af Fulminant Myocarditis ved lysarkmikroskopi
Summary
Her beskriver vi en lysarkmikroskopi tilgang til visualisering af den kardiale CD45 + leukocytinfiltreret i en murin model af aseptisk fulminant myocarditis, som induceres af intratracheal difteritoksinbehandling af CD11c.DTR-mus.
Abstract
Fluorescensmikroskopi (LSFM), i kombination med kemiske clearingprotokoller, er blevet guldstandarden til analyse af fluorescensmærkede strukturer i store biologiske prøver og er ned til cellulær opløsning. I mellemtiden giver den konstante forfining af underliggende protokoller og den øgede tilgængelighed af specialiserede kommercielle systemer os mulighed for at undersøge mikrostrukturen af hele musorganer og endda tillade karakterisering af cellulær adfærd i forskellige levende cellebilledfremgangsmåder. Her beskriver vi en protokol til rumlig helmonteret visualisering og kvantificering af CD45 + leukocytpopulationen i betændte museshjerter. Metoden anvender en transgen musestamme (CD11c.DTR), der for nylig er blevet vist at fungere som en robust inducerbar model til undersøgelse af udviklingen af fulminant dødelig myocarditis, karakteriseret ved dødelig hjertearytmi. Denne protokol omfatter myokarditis induktion, intravitAl-antistof-medieret cellefarvning, orgelpræparation og LSFM med efterfølgende computerassisteret billede efterbehandling. Selvom præsenteret som en meget tilpasset metode til vores specifikke videnskabelige spørgsmål, repræsenterer protokollen tegningen af et let justerbart system, som også kan målrette helt forskellige fluorescerende strukturer i andre organer og endda i andre arter.
Introduction
Under udviklingen af lysmikroskopi fremkom mange specialiserede former, der alle udviklede sig for at minimere begrænsninger i visualiseringsprocessen for bestemte prøver. En sådan metode er fluorescensmikroskopi (LSFM) i lysark. Først udviklet i 1903 af Siedentopf og Zsigmondy 1 og fundet sine første grundlæggende biologiske anvendelser i begyndelsen af 1990'erne 2 , er LSFM blevet det mest kraftfulde mikroskopiske værktøj til dato for visualisering af store prøver, såsom intakte musorgener, med en fluorescenssignalopløsning Ned til det cellulære niveau. På grund af disse fordele, i kombination med dets potentiale for live-celle billeddannelse, kaldte Nature Methods LSFM "Årets metode 2014 3. "
Som navnet antyder, udføres prøvebelysningen i en LSFM af lette ark, som er orienteret vinkelret på aksen for det anvendte mål fEller emission-lysindsamling og efterfølgende billeddannelse. Lysarket genereres normalt enten ved at fokusere brede, kollimerede laserstråler med en cylindrisk linse eller ved den hurtige sideløbende bevægelse af smalle, fokuserede laserstråler i blot et vandret eller lodret plan 4 , 5 . På denne måde lyser kun billedoptikens fokalplan, typisk med en tykkelse på 1-4 μm. Følgelig elimineres eller genereres stærkt undertryk 6 , 7 for en fluorescerende prøve anbragt i belysningsplanet, både genereringen af spredt lys og virkningerne af fotobleaching fra regioner over eller under brændpunktet. Da alle out-of-focus-planer ikke er belyste, bortfalder fotobeløbseffekter i disse områder. I modsætning til standard konfokal- eller multi-fotonmikroskopi er vejene i belyst og udsendt lys adskilt fra hinanden, så den endelige billedkvalitet Ity afhænger ikke af den perfekte fokusering af excitationslysstrålen gennem målene. Afhængigt af det underliggende spørgsmål er det derfor muligt at anvende målsætninger med et enormt synsfelt (FOV), så det største mulige område af det belyste plan kan afbildes uden at nogen komponentdele bevæger sig i xy-retningen.
I moderne LSFM-systemer er et fluorescerende billede af den genererede optiske sektion indfanget på en meget følsom ladningskoblet enhed (CCD) eller komplementære kameraer med metaloxidhalvleder (CMOS), som er i stand til at erhverve hele synsfeltet (FOV) I mikrosekunder. Ved at flytte prøven gennem lyspladen og ved at erhverve billeder ved definerede z-trin er det derfor muligt at opnå den fulde 3D-information af en prøve i en rimelig tidsperiode 8 , 9 , hvilket gør denne teknik gældende for levende celle Undersøgelser 10 ,Ass = "xref"> 11 , 12 .
Ikke desto mindre, selvom LSFM tilbyder en hurtig, følsom og fluorescensvenlig metode, er lysoverførsel gennem prøven stadig et stort problem, især når store biologiske prøver er målet for en 3D-analyse. Lystransmission modificeres kritisk af fysiske aspekter af absorption og ved lysspredning ved grænseflader af strukturer med forskellige brydningsindekser 13 . Derfor, når billeddannelsesprøver er flere millimeter i størrelse, er LSFM for det meste kombineret med clearingprotokoller for at gøre prøverne optisk transparente. Disse teknikker er baseret på ideen om at fjerne vand fra det respektive biologiske væv og udveksle det med vand- eller (organisk) opløsningsmiddelbaseret nedsænkningsmedium, som er valgt til at snævre matche brydningsindekserne for de specifikke målvævskomponenter. Som et resultat minimeres sidestrålespredning og alle bølgelængderAf lys kan langt mere effektivt passere gennem vævet 13 . I mange tilfælde virker biologiske prøver, der behandles på denne måde, makroskopisk krystalklare, hvilket gør det muligt for LSFM at udføres, selv på hele musorganerne, ved hjælp af lange arbejdsstørrelsesmål med lav forstørrelse.
Her præsenterer vi en forberedelsesprotokol til storprøveafbildning i et lysarkmikroskop (se materialebordet), som vi har etableret for at undersøge det cellulære hjerteinfiltrat i en murin model af myocarditis 15 . CD11c.DTR-mus udtrykker primat difteri-toksinreceptoren (DTR) under kontrol af CD11c-promotoren 16 . Følgelig gøres celler i disse mus, som udtrykker CD11c sammen med DTR'en, følsomme overfor exotoxinet af Corynebacterium diphtheria (difteritoksin, DTX); Den systemiske behandling af disse dyr med DTX resulterer i en udtømning af alle CD11c + ceLLS. CD11c er et integrin og er som en celleoverfladereceptor for en række forskellige opløselige faktorer involveret i aktiverings- og modningsfremgangsmåder hovedsageligt i celler af den monocytiske linie 17 . Følgelig er CD11c.DTR-musemodellen blevet anvendt intensivt til at studere rollen som dendritiske celler og makrofagundergrupper i sammenhæng med mange forskellige immunologiske spørgsmål. Over tid er det blevet rapporteret, at CD11c.DTR mus behandlet systemisk med DTX kan udvikle bivirkninger og kan vise stærkt forhøjede dødelighed 18 , 19 . For nylig var vi i stand til at identificere den underliggende dødsårsag 15 , der beskriver udviklingen af fulminant myocarditis efter intratracheal DTX ansøgning i disse dyr. Toxinudfordringen forårsagede cellulær destruktion, herunder i centrale dele af stimulusoverførselssystemet i hjertet. Dette blev ledsaget af massiv CD45+ Leukocyt infiltrere, som endelig fører til dødelige hjertearytmier. I dette tilfælde var udseendet af leukocytpopulationen vigtig, men også dens rumlige fordeling inde i hjertet. Dette eksperimentelle spørgsmål er en udfordring for moderne mikroskopisk billeddannelse, som vi har løst ved en mikroskopisk tilgang til lysark, der understøttes af intravital antistoffarvning og en organisk opløsningsmiddelbaseret optisk clearingsprotokol.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den moderne livsvidenskab spiller den mikroskopiske visualisering af biologiske processer en stadig vigtigere rolle. I den forbindelse er der sket mange udviklinger i løbet af de sidste to århundreder, der hjælper med at besvare spørgsmål, der ikke kan adresseres til dette punkt. For det første har der været en klar tendens til grundlæggende at øge opløsningsmulighederne for lysmikroskoper. Med struktureret belysningsmikroskopi (SIM) 21 , 22 , stimul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen i Gunzer-laboratoriet blev støttet af det tyske forbundsministerium for uddannelse og forskning (tilskud nr. 0315590 AD) og af det tyske forskningsstiftelse (tilskud nr. GU769 / 4-1, GU769 / 4-2). Vi takker også IMCES for teknisk support og Sebastian Kubat for hjælp til 3D tegneserie modellering.
Materials
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/ml] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 ml) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15x15x5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
References
- Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2 (3), (2015).
- Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705 (2007).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), (2010).
- Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207 (2013).
- Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).
- Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).
- Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).
- Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).
- Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).
- Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).
- Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).
- Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. , (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10 (4), 44014 (2005).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).
- Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
