התנהגות פולשנית של תאים סרטניים בשד אדם עוברי הזברה
Summary
כאן, אנו מתארים דגמים דג הזברה xenograft באמצעות שני אתרים הזרקה שונים, כלומר, חלל צינור perivitelline של קיביה, כדי לחקור את התנהגות פולשנית ולהעריך את הפוטנציאל intravasation ו extravasation של תאי סרטן שד אנושיים, בהתאמה.
Abstract
במקרים רבים, חולי הסרטן אינם מתים של גידול ראשוני, אלא בגלל גרורות. למרות במודלים של מכרסמים רבים זמינים לחקר גרורות סרטן in vivo, מודלים יעילים, אמינים, בעלות נמוכה אחרים נדרשים לגשת ההשפעות הפוטנציאליות במהירות של (EPI) שינויים גנטיים או תרכובות תרופתיות. ככזה, אנו מדגימים ומסבירים את ההיתכנות של מודלים xenograft באמצעות תאי סרטן שד אנושיים מוזרק לתוך עוברי דג הזברה כדי לתמוך ביעד זה. תחת מיקרוסקופ, חלבוני ניאון או תאי סרטן שד אנושיים שכותרתו כימית מושתלים לתוך עוברי דג הזברה מהונדס, Tg (FLI: EGFP), על שטח perivitelline או צינור של קיביה (דוק) 48 שעות לאחר ההפריה. זמן קצר לאחר מכן, בתהליך הזמן- מרחב של פלישת תאים סרטניים, הפצה, וגרורה בגוף דגי החיים הוא דמיין תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. המודלים באמצעות מוזרקים שונים, כלומר, לכלשטח או דוק ivitelline הם משלימים אחד את השני, המשקף את השלב המוקדם (שלב intravasation) ושלב מאוחר (שלב extravasation) של מפל גרורתי רב שלבי של אירועים. יתר על כן, אנגיוגנזה peritumoral ו intratumoral ניתן לצפות עם הזרקה לתוך שטח perivitelline. תקופת הניסוי כולו הוא לא יותר מ 8 ימים. שני המודלים הללו משלבים תיוג תא, מייקרו-להשתלה, וטכניקות דימות פלואורסצנטי, המאפשרים ההערכה המהירה של גרורות סרטן בתגובת מניפולציות גנטיות תרופתיות.
Introduction
גרורות סרטן גלויות המרפאה כוללות סדרה של אירועים מורכבים ורב-צעד המכונים "המפל גרורתי". האשד נבדק בהרחבה ניתנת גזור לתוך צעדים רצופים: פלישה מקומית, intravasation, הפצה, מעצר, extravasation, והקולוניזציה 1, 2. הבנה טובה יותר של הפתוגנזה של גרורות סרטן לבין ההתפתחות של אסטרטגיות טיפול פוטנציאל in vivo דורשת מודלים מארחים חזקים של התפשטות תאים סרטניים. מודלים מכרסמים מבוססים היטב והם בשימוש נרחב כדי להעריך גרורות 3, אך גישות אלה יש יעילות נמוכה ומגבלות אתיות והם יקרים כמודל חנית כדי לקבוע אם מניפולציה מסוימת יכולה להשפיע על הפנוטיפ גרורתי. מודלים יעיל, אמינה, בעלות נמוכה אחרים נדרשים לגשת ההשפעות הפוטנציאליות במהירות של (EPI) שינויים גנטיים או pharmacologתרכובות iCal. בשל ההומולוגיה הגנטית הגבוהה שלהם לבני אדם ואת השקיפות של דג הזברה עוברת שלהם (Danio rerio) צמח כמודל החולייתנים חשוב מיושמים ויותר בחקר תהליכים התפתחותיים, אינטראקציות החיידק-host, מחלות אנושיות, הקרנת סמים, וכו ' . 4. המודלים הגרורים הסרטן הוקמו בשנת דג זברה עשויים לספק תשובה לחסרונות של מודלים מכרסמים 5, 6.
למרות neoplasia הספונטנית נתפסת בקושי דג הזברה פרא 7, קיימים מספר טכניקות ארוכות שנים לגרום לסרטן רצוי דג הזברה. מוטציות גנטיות המושרה Carcinogen או הפעלת מסלול איתות יכול היסטולוגית ו סרטן מודל מולקולרי, מחקה מחלות אנושיות דג הזברה 7, 8, 9. By טאקing יתרון של מגוון קדימה לאחור מניפולציות גנטיות של אונקוגנים או מדכאי גידול, (מהונדס) דג זברה גם אפשרה מחקרים הפוטנציאל של היווצרות הסרטן ותחזוקה 6, 10. מודלי סרטן מושרה דג הזברה לכסות ספקטרום רחב, כולל עיכול, רבייה, דם, מערכת עצבים, וכן האפיתל 6.
הניצול של דג זברה בחקר הסרטן הרחיב לאחרונה בשל הקמת מודלי xenograft התא אנושיים גידולים אורגניזם זה. זה דווח לראשונה עם תאי מלנומה גרורתית אדם שהיו engrafted בהצלחה עוברי דג הזברה בשלב blastula ב 2005 11. מעבדות עצמאיות כמה אימתו את הכדאיות של עבודה חלוצית זו על ידי הצגת מגוון רחב של קווי תאים סרטניים יונקים לתוך דג הזברה באתרים שונים בשלבים התפתחותיים 5 </ Sup>. לדוגמה, זריקות ליד blastodisc ו הבלסטוציסט הבמה blastula; זריקות לתוך שק החלמון, מרחב perivitelline, צינור של קיביה (דוק), וריד הקרדינל האחורי של 6-H- עוברי 5 ימים בת; וזריקות לתוך חלל הצפק של זחלי immunosuppressed בן 30 ימים בוצעו 5, 12. בנוסף, השתלות גידול אלוגנאית גם דווחו דג הזברה 12, 13. אחד היתרונות הגדולים של שימוש xenografts היא כי תאי סרטן engrafted יכול להיות שכותרתו fluorescently בקלות ומכובדת לתאים נורמליים. לפיכך, חקירות לתוך ההתנהגויות הדינמיות של היווצרות microtumor 14, פלישת תא וגרורות 15, 16, 17, אנגיוגנזה מושרה גידולים 15, 1 8, ואת יחסי הגומלין בין תאים סרטניים לבין המארח גורמי 17 ניתן דמיינו בבירור בגוף דגים חיים, במיוחד כאשר קווי דג הזברה מהונדס מוחלים 5.
בהשראת הפוטנציאל הגבוה של מודלי xenograft דג זברה להעריך גרורות, הראינו את מאפייני extravasation transvascular של שורות תאי סרטן השד שונות באזור הסנפיר של Tg (FLI: EGFP) עוברי דג זברה דרך זריקות דוק 16. תפקידו של הפיכת גורם גדילה-β (TGF-β) 16 ועצם חלבון המוךפו"גנטי שהולך (BMP) 19 מסלולי איתות הפלישה תאים סרטניים פרו / אנטי-שד וגרורות נחקרו גם במודל זה. יתר על כן, אנחנו גם סיכם את היכולת intravasation של שורות תאים סרטניים שונים השד למחזור באמצעות מודלים דג הזברה xenograft עם זריקות מרחב perivitelline.
<p class = "jove_content"> מאמר זה מציג פרוטוקולים מפורטים דגמי xenograft דג הזברה מבוסס על הזרקה של תאי סרטן שד אנושיים לחלל perivitelline או דוק. באמצעות דימות פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה, אנו מציגים את תהליך נציג intravasation לתוך כלי דם ואת ההתנהגות פולשנית של תאים סרטניים בשד אנושיים שונים, אשר עוברים כלי הדם לאזור סנפיר avascular.Protocol
Representative Results
Discussion
הנה, תיארנו שתי שיטות לחקור את התנהגות פולשנית של תאים סרטניים בשד ב Tg (fli1: EGFP) עוברי דג הזברה, עם זריקות מרחב perivitelline ו דוק. באמצעות הזרקת תאי סרטן שכותרתו עם צבע כימי או חלבון פלואורסצנטי לתוך עוברי דג זברה מהונדסים, המאפיינים הדינמיים המרחבי של פלישה גרורה ניתן ל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקרים על בני המשפחה-β TGF נתמכים על ידי הולנד המרכז Genomics סרטן. Sijia ליו ג'יאנג רן נתמכים על ידי המועצה מלגות סין עבור 4 שנות לימוד באוניברסיטת ליידן. אנו מודים לד"ר פרד מילר (ברברה אן Karmanos מכון הסרטן, דטרויט, מישיגן, ארה"ב) עבור שורות תאים MCF10A.
Materials
| Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
| Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
| DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
| Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
| Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
| HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
| Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
| MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul) | Eppendorf | F276456I | |
| pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
| pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
| Prism 4 software | GraphPad Software | ||
| pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
| Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
| Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
| Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
| Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |
References
- Wan, L., Pantel, K., Kang, Y. Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic. Nat. Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a distance: Organ-specific metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
- Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol. Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., et al. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC cancer. 13 (1), 453 (2013).
- Konantz, M., Balci, T. B., Hartwig, U. F., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266 (1), 124-137 (2012).
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 34 (1), 80 (2015).
- Stanton, M. F. Diethylnitrosamine-induced hepatic degeneration and neoplasia in the aquarium fish, Brachydanio rerio. J. Natl. Cancer Inst. 34 (1), 117-130 (1965).
- Lam, S. H., Wu, Y. L., Vega, V. B., et al. Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression. Nat. Biotechnol. 24 (1), 73-75 (2006).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research-advantages and current limitations. Toxicol. Pathol. 31, 62-87 (2003).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., et al. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Dev. Dynam. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat. Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., et al. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Rouhi, P., Jensen, L. D., Cao, Z., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat. Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Drabsch, Y., He, S., Zhang, L., et al. Transforming growth factor-β signalling controls human breast cancer metastasis in a zebrafish xenograft model. Breast Cancer Res. 15 (6), R106 (2013).
- He, S., Lamers, G. E., Beenakker, J. W., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- de Boeck, M., Cui, C., Mulder, A. A., et al. Smad6 determines BMP-regulated invasive behaviour of breast cancer cells in a zebrafish xenograft model. Sci. Rep. 6, 24968 (2016).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Stewart, S. A., Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat. Rev. Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).
