Invasiv Opførsel af humane brystcancerceller i embryonale zebrafisk
Summary
Her beskriver vi xenograft zebrafisk modeller ved hjælp af to forskellige injektionssteder, dvs. perivitelline plads og kanal- af Cuvier, for at undersøge den invasive adfærd og vurdere intravasation og ekstravasation potentiale af humane brystkræftceller, hhv.
Abstract
I mange tilfælde behøver cancerpatienter ikke dø af en primær tumor, men snarere på grund af metastaser. Skønt talrige gnavermodeller er tilgængelige til undersøgelse cancermetastase in vivo, er behov for andre effektive, pålidelige, billige modeller til hurtigt at få adgang de potentielle virkninger af (epi) genetiske ændringer eller farmakologiske forbindelser. Som sådan, vi illustrere og forklare mulighederne for xenograftmodeller med humane brystkræftceller sprøjtes ind zebrafiskembryoer at støtte dette mål. Under mikroskopet er fluorescerende proteiner eller kemisk mærkede humane brystcancerceller transplanteret ind transgene zebrafiskembryoer, Tg (Fli: EGFP), ved perivitelline rum eller kanalen i Cuvier (dok) 48 timer efter befrugtningen. Kort efter er den tidsmæssige-rumlige proces med cancercelleinvasion, formidling, og metastase i den levende fisk krop visualiseres under et fluorescerende mikroskop. Modellerne anvender forskellige injektionssteder, dvs. privitelline rum eller Doc er komplementære til hinanden, hvilket afspejler den tidlige fase (intravasation trin) og sen fase (ekstravasation trin) af flertrins-metastatiske kaskade af hændelser. Desuden kan peritumoral og intratumoral angiogenese iagttages med injektion i perivitelline rum. Hele forsøgsperiode er ikke mere end 8 dage. Disse to modeller kombinerer celle mærkning, mikro-transplantation, og fluorescens billeddannelse teknikker, giver mulighed for hurtig evaluering af kræft metastaser som reaktion på genetiske og farmakologiske manipulationer.
Introduction
Åbenlys cancermetastase i klinikken omfatter en række komplekse og flere trin begivenheder kendt som "metastatisk kaskade". Den kaskade er blevet grundigt gennemgået og kan dissekeres i successive trin: lokal invasion, intravasation, udbredelse, arrest, ekstravasation og kolonisering 1, 2. En bedre forståelse af patogenesen af kræft metastaser og udvikling af potentielle behandlingsstrategier in vivo kræver robuste vært modeller af kræftcelle spredning. Gnavermodeller er veletablerede og er almindeligt anvendt til at evaluere metastaser 3, men disse metoder har lav effektivitet og etiske begrænsninger og er dyre som en forkant model til at afgøre, om en bestemt manipulation kan påvirke metastatisk fænotype. Andre effektive, pålidelige, billige modeller er behov for hurtigt at få adgang til de potentielle virkninger af (epi) genetiske ændringer eller pharmacologgiske forbindelser. Grund af deres høje genetisk homologi til mennesker og gennemsigtigheden af deres embryoner zebrafisk (Danio rerio) er dukket op som en vigtig hvirveldyr model og i stigende grad anvendes til studiet af udviklingsprocesser, mikrobe-værtssammenspil, humane sygdomme, lægemiddelscreening, etc . 4. De kræft metastase-modeller, der er etableret i zebrafisk kan give et svar på manglerne i gnavermodeller 5, 6.
Selvom spontan neoplasi næppe ses i vild zebrafisk 7, er der flere langvarige teknikker til at fremkalde den ønskede kræft i zebrafisk. Carcinogen-induceret genmutationer eller signalvejen aktivering kan histologisk og molekylært model carcinogenese, efterligner human sygdom i zebrafisk 7, 8, 9. ved taking fordel af forskelligartede forward og reverse genetiske manipulationer af onkogener eller tumorsuppressorer, (transgene) zebrafisk har også gjort det muligt potentielle studier af dannelsen og vedligeholdelsen 6, 10 cancer. De inducerede kræftmodeller i zebrafisk dækker et bredt spektrum, herunder fordøjelsessystemet, reproduktive, blod, nervesystem, og epitelial 6.
Udnyttelsen af zebrafisk i kræftforskning har udvidet for nylig på grund af etableringen af menneskelige tumor-xenograftmodeller i denne organisme. Dette blev først rapporteret med human metastatisk melanom celler, der lykkedes indpodede i zebrafisk embryoner på blastula scenen i 2005 11. Flere uafhængige laboratorier har valideret gennemførligheden af dette pionerarbejde ved at indføre en bred vifte af cancerceller hos pattedyr linjer i zebrafisk på forskellige steder og udviklingsstadier 5 </ Sup>. For eksempel injektioner nær kimskiven og blastocyt i blastula-stadiet; injektioner i blommesækken, perivitelline rum, kanalen i Cuvier (dok), og posterior kardinalvene af 6-H- til 5 dage gamle embryoner; og injektioner i peritonealhulen af 30 dage gammel immunundertrykt larver er blevet udført 5, 12. Derudover blev også rapporteret allogen tumor transplantationer i zebrafisk 12, 13. En af de store fordele ved at bruge xenotransplantater er, at podede cancerceller let kan fluorescensmærket og skelnes fra normale celler. Derfor undersøgelser af dynamiske adfærd af microtumor formation 14, og -metastase 15, 16, 17, tumor-induceret angiogenese 15, 18, og samspillet mellem cancerceller og vært faktorer 17 klart kan visualiseres i levende fisk krop, især når transgene zebrafisk linjer påføres 5.
Inspireret af det store potentiale af zebrafisk xenograftmodeller at evaluere metastase, demonstrerede vi de transvaskulær ekstravasation angår forskellige brystcancercellelinier i halefinne område i Tg (Fli: EGFP) zebrafiskembryoer gennem Doc injektioner 16. Rollen af transformerende vækstfaktor-β (TGF-β) 16 og knoglemorfogenetisk protein (BMP) 19 signalveje i pro / anti-brystcancer og -metastase blev også undersøgt i denne model. Desuden har vi også sammenfattet den intravasation evne forskellige brystcancercellelinier i omsætning med xenograft zebrafisk modeller med perivitelline space injektioner.
<p class = "jove_content"> Denne artikel præsenterer detaljerede protokoller for zebrafisk xenograftmodeller baseret på injektionen af humane brystcancerceller i perivitelline rum eller dok. Ved hjælp af høj opløsning fluorescensimagografi, viser vi den repræsentative proces med intravasation i blodkarrene og den invasive opførsel af forskellige humane brystcancerceller, som flytter fra blodkarrene i den avaskulære halefinne område.Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrev vi to metoder til at undersøge den invasive opførsel af brystcancerceller i Tg (FLI1: EGFP) zebrafiskembryoer, med perivitelline rum og dok injektioner. Ved at injicere cancerceller mærket med kemisk farvestof eller fluorescerende protein i transgene zebrafiskembryoer, kan de dynamiske og rumlige karakteristika for invasion og metastase tydeligt spores i realtid på enkelt-celle eller klyngeniveau under et fluorescensmikroskop. I de fleste tilfælde den hurtige progression af metastase i zebrafis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Undersøgelser af TGF-β familiemedlemmer understøttes af Cancer Genomics Centre Holland. Sijia Liu og Jiang Ren understøttes af Kina Scholarship Rådet for 4 års studier ved universitetet i Leiden. Vi takker Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) for de MCF10A cellelinjer.
Materials
| Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
| Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
| DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
| Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
| Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
| HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
| Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
| MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul) | Eppendorf | F276456I | |
| pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
| pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
| Prism 4 software | GraphPad Software | ||
| pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
| Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
| Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
| Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
| Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |
References
- Wan, L., Pantel, K., Kang, Y. Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic. Nat. Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a distance: Organ-specific metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
- Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol. Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., et al. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC cancer. 13 (1), 453 (2013).
- Konantz, M., Balci, T. B., Hartwig, U. F., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266 (1), 124-137 (2012).
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 34 (1), 80 (2015).
- Stanton, M. F. Diethylnitrosamine-induced hepatic degeneration and neoplasia in the aquarium fish, Brachydanio rerio. J. Natl. Cancer Inst. 34 (1), 117-130 (1965).
- Lam, S. H., Wu, Y. L., Vega, V. B., et al. Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression. Nat. Biotechnol. 24 (1), 73-75 (2006).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research-advantages and current limitations. Toxicol. Pathol. 31, 62-87 (2003).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., et al. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Dev. Dynam. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat. Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., et al. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Rouhi, P., Jensen, L. D., Cao, Z., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat. Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Drabsch, Y., He, S., Zhang, L., et al. Transforming growth factor-β signalling controls human breast cancer metastasis in a zebrafish xenograft model. Breast Cancer Res. 15 (6), R106 (2013).
- He, S., Lamers, G. E., Beenakker, J. W., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- de Boeck, M., Cui, C., Mulder, A. A., et al. Smad6 determines BMP-regulated invasive behaviour of breast cancer cells in a zebrafish xenograft model. Sci. Rep. 6, 24968 (2016).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Stewart, S. A., Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat. Rev. Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).
